[发明专利]百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于植物病毒检测的生物技术产品，具体涉及一种可用于对百合斑驳病毒病进行快速灵敏检测的百合斑驳病毒(LMoV)双抗体夹心酶联免疫(DAS-ELISA)检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。

背景技术

百合(Lilium spp.)传统上是药用和食用植物，现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。荷兰是世界最大的百合种球生产国，2005年荷兰百合种球生产面积达3800hm²，约占世界切花百合生产总面积的72％。切花百合在我国花卉产业产值中占第四位，同时百合作为食品和药材，也是一种重要的经济作物。随着百合种植面积日益扩大，高密度种植和长期无性繁殖使病毒不断积累，病毒病对百合的危害日趋严重，影响了百合的产量和品质，给百合种植业造成巨大的经济损失。而百合的抗病毒品种极少，加上引种频繁，鲜花进出口频率高，加速了病毒的传播。据报道，现已知百合病毒病原有14种，类菌原体1种，其中为害严重的病毒有4种，即百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottlevirus，LMoV)和百合病毒X(Lily virus X，LVX)，其他各种病毒均为局部地区发生，百合病毒常复合侵染，不同病毒在百合上表现相似症状，同种病毒在不同条件下的症状有很大变异。

LMoV可在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。侵染百合科植物常造成严重的叶片斑驳症状、植株形态异常和球茎减小。百合斑驳病毒属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。病毒粒子呈弯曲线状且呈螺旋对称，大小(650～900)nm×(11～15)nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，5’端缺少帽子结构，连接一个VPg蛋白，3’端带有Poly(A)尾。基因组包含一个长ORF，编码相对分子质量约340kDa的多聚蛋白，并通过病毒编码的蛋白酶，即P1、HC-Pro和NIa切割形成十个不同大小的病毒蛋白。其中CP是外壳蛋白，分子量为30kDa，它一方面负责组装病毒粒子包裹病毒RNA，另一方面参与蚜虫介导的病毒传播，而且靠近外壳蛋白的N端的氨基酸序列决定蚜虫的传播能力；CI是细胞质内含体蛋白，在病理组织细胞质内形成电镜下特征明显的风轮状结构，可能与病毒的胞间运动有关。

要减少病毒病在百合种植业中的损失，最便捷的方法是采用脱毒培养。国内现在大量采用脱毒培养技术，但依然存在不少问题，其中之一就是是缺少方便快捷、准确可靠的病毒检测方法。

目前国内外对百合斑驳病毒的主要检测手段有指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测和免疫学检测等。其中指示植物检测为较为传统的检测方法，测试条件受外界环境变化影响会出现不同的检测结果，检测周期也很长，操作十分复杂，检测结果不准确。

电镜检测灵敏度不高，需要大量病毒样本，检测过程复杂，并且检测结果受主观影响较大。由于电子显微镜代价昂贵，对大多数检测来说不具备条件。

分子生物学检测方法操作较为简单，通过病毒特异性引物进行RT-PCR检测，所需检测时间较短。但由于该病毒是单链正链RNA病毒，制备用于检测的样本模板较为复杂，对检测实验条件要求很高，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。需要有相当经验的操作者才能获得较为可靠的结果。

免疫学检测方法基于病原的一种或多种蛋白质与动物针对抗原产生的抗体间的相互作用。在植物病毒检测中其优势在于：①反应特异；②反应迅速；③一定范围内可定量化；④灵敏；⑤抗血清可长期储存；⑥适合批量检测、操作难度低、检测费用低。因此适合作为大规模商业检测方法推广。

目前国内外尚无商品化的LMoV免疫检测试剂盒，著名植物病毒试剂盒检测公司Agdia也仅有马铃薯Y病毒属通用免疫试纸条实现了商品化，而没有专一检测LMoV的试剂盒，另外国外植物病毒诊断试剂价格昂贵，如Agdia公司试剂盒多在人民币1500～4000元之间，很难满足国内花卉及食用百合的脱毒检测需求。因此建立灵敏、稳定、高通量和易操作的百合斑驳病毒检测方法及试剂盒，是生产百合脱毒株的基础，是提高花卉百合品质和食用药用百合产量和质量的前提。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确高效、经济简便、易于推广使用的双抗体夹心酶联免疫检测方法及试剂盒，以及该试剂盒的制备方法。

本发明的技术问题通过下述技术方案解决：