[发明专利]百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种百合斑驳病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，包括辅助试剂：底物反应液、洗涤缓冲液、提取缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液，其特征在于还包括96孔多克隆抗体包被板、辣根过氧化物酶标记多克隆抗体、LMoV重组融合蛋白PI200标准品、质控品。

2.一种如权利要求1所述检测试剂盒的制备方法，包括标准品的制备、多克隆抗体包被板的制备、酶标多克隆抗体的制备、质控品的制备以及辅助试剂的制备，其特征在于所述LMoV重组融合蛋白PI200标准品的制备，以感染LMoV的百合叶片的总RNA为模板，使用两对引物CP-F/CP-R，CI200-F/CI200-R分别扩增LMoV的CP基因及CI200(CI基因C端600bp)片段，中间以(Gly)₅作为柔性连接，共同克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET-28a-CP-CI200，表达得到大小56.5kDa的融合蛋白PI200。

3.如权利要求2所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述融合蛋白PI200的氨基酸序列为：

MGANETLNAGASSSTQASRSTRPEAAIDVAPQQSSEARVRDRDVDAGTVGTYQIPRLKALATKINVPKVKGRMIVNTGHLVNYNPDQTDISNTRSTQKQFETWYNAVKDEYGLNDESMALAMNGLMVWCIENGTSPNVNGVWLMMDGDQQVEFPLRPILEHAKPTLRQIMAHFSNLAEAYIEKQNLEKPYMPRYGLQRNLTDFNLARFAFDFYEVTSRTPARAKEAHFQMKTAALRGKQSKLFGLDGKVNTQDEDTERHTADDVNKNMHSLLGISMGGGGGASTMHPEVHRILTPYKLRDSEIILNKVAIPNKGLMQWPTAKEYAYQGFKMNIPDTVRLPFHSLDIPERLHERMWQIVETHKGDAGFGRITTASACKIAYTLKTDAASIQRTIHILDKLIENELKKQEYFRNITSASCSSSSFSLTTITNAIRARHIKDHTVENVSVLQAAKAQILEFKNVTFDLDHVNRMTEYGALECVQFQGNSSSVDKLAAALEHHHHHH。

4.如权利要求2所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的重组蛋白PI200扩增外壳蛋白CP基因的引物设计为：

上游引物：5’-CCATGGGCGCAAATGAGACACTCAATGC-3’

              NcoI   下游引物：5’-GAATTCCCGCTAGCTCCACCTCCTCCACCCATAGAAATTCCAAGTAAGGAGT-3’

             EcoRI  NheI  (Gly)₅-Linker

5.如权利要求2所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的重组蛋白PI200扩增细胞质内含体CI基因C端600bp的引物设计为：

上游引物：5’-GCTAGCACTATGCACCCAGAGGTACA-3’

              Nhe I

下游引物：5’-GAATTCCCCTGAAATTGGACACACTCC

              EcoRI

6.如权利要求2所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述多克隆抗体包被板，用纯化的融合重组蛋白PI200免疫获得的多克隆抗体包被酶标板制作。

7.如权利要求2所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述多克隆酶标抗体，是用纯化的融合重组蛋白PI200免疫兔获得的多克隆抗体标记辣根过氧化物酶制作的。