[发明专利]一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法。

背景技术：

超氧化物歧化酶(SOD)是一种能催化超氧阴离子自由基歧化反应的金属酶，其主要作用是能专一地清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是生物体防御活性氧毒害的关键性防线，能预防或治疗由超氧阴离子自由基引起的多种疾病，是一种很有用途的药用酶，对人体血栓症、动脉硬化、高血糖有一定的预防和辅助治疗作用，还具有抗衰老、抗辐射和防止细胞突变等作用具有能够清除体内过多氧自由基的特性，从而在医学、食品、化妆品等领域得到广泛的应用。

自1969年首次从牛红细胞中分离出SOD以来，人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯化出SOD。现在我国大部分都是采用生化方法提取SOD，如基因合成、微生物发酵以及化学提取，同时在SOD纯化中大多使用琼脂糖凝胶法和阴阳离子树脂交换法等方法，这些方法普遍存在生产工艺复杂、成本高、周期长等缺点。

我国作为猪肉产业大国，拥有丰富的猪血资源，但大部分猪血除了进行简单加工做饲料用外，则被直接抛弃，不仅极大地浪费了猪血资源，还严重污染了环境。猪血中的的营养成分丰富，除含有丰富的蛋白外，还含用超氧化物歧化酶(SOD)等活性物质，对猪血进行SOO的有效提取将极大提高猪血的附加值，产生良好的经济效益。

发明内容：

本发明的目的就在于克服上述常规方法中存在的不足，而提供一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，该方法工艺简单、生产周期短、适合工业化生产。

如上构思，本发明的技术方案是：一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于：依照如下步骤进行：

(1)向猪血中加入抗凝剂，离心3000rpm离心10～30min去血浆，收集红细胞；然后加入红细胞体积3～5倍的0.9％NaCl溶液进行清洗，离心4000rpm离心10～30min，弃去上清液后，收集红细胞并加入红细胞体积1～3倍体积的去离子水，0～4℃水浴下静置10-15h后得到溶血液；

(2)向溶血液中缓慢加入4℃以下冷预过的95％乙醇后，再缓慢加入预冷过的的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；

(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；

(4)将沉淀物用加入1-3倍体积的去离子水进行溶解，并进行热处理后，迅速冰浴至4℃以下，然后，加入K₂HPO₄缓冲液，搅拌、离心后获得上清液；

(5)采用螺旋梯度洗脱技术对上清液进行纯化处理，获得纯化酶液；

(6)将纯化酶液通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得最终的猪血SOD成品。

上述抗凝剂采用草酸钾溶液，其浓度为2～5％，其体积是猪血体积的10％。

上述去离子水的pH＝9。

上述步骤(2)中95％乙醇的加入量是溶血液体积的0.2～0.5倍，氯仿的加入量是溶血液体积的0.1～0.5倍，溶血液加入95％乙醇和氯仿后搅拌10-20min、静置0.5-1h、4000rmp离心10～30min，收集上清液获得粗酶液。

上述步骤(3)中丙酮的加入量是粗酶液体积的1～3倍，粗酶液加入丙酮后搅拌10-15min，4000rmp离心10～30min，取沉淀物。

上述步骤(4)中热处理的条件为温度40～70℃、时间10～30min；K₂HPO₄缓冲液的加入量是沉淀物体积的20～30倍，沉淀物加入K₂HPO₄缓冲液后搅拌5-8min，然后4000rmp离心10～30min，获得上清液。

上述步骤(5)中螺旋梯度洗脱技术采用浓度为2～50mmol/L、pH值为7.2～9.0的K₂HPO₄缓冲液通过梯度盐析原理使杂质逐级沉淀的方法来实现SOD酶的纯化。

本发明的优点是：本发明综合生物与化学方法，采用高效分离、提取及纯化技术，生产方法简单、周期短、污染小，适用于大规模工业化生产。经检测，采用本方法提取的猪血Cu/Zn-SOD，其单位酶活可以达到6000U/mg以上。

具体实施方式：

实施例1：