[发明专利]一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因家族中基因种类的方法及专用试剂盒。

背景技术

小麦是世界上最重要的三大粮食作物(小麦、水稻和玉米)之一，世界上每年总产量达到6亿吨以上(http://faostat.fao.org/)。小麦在我国得到了广泛的种植，我国的小麦种植面积、总产量和消费量皆居世界首位，目前是我国的第三大粮食作物，仅次于水稻和玉米。小麦之所以能够在世界各地得到很好的发展，最关键的是小麦具有独特的特性，其面粉可以被加工成各种各样的面食，如面包、蛋糕、饼干、面条和馒头等。这种独特特性的形成主要依赖于小麦籽粒储藏蛋白——面筋蛋白的结构和相互作用，即小麦面粉加工品质的好坏主要取决于面筋蛋白的数量和质量。这些面筋蛋白之间可以通过很强的共价键和非共价键相互作用，赋予面团粘弹特性。面筋蛋白主要包括醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)，其中麦谷蛋白可以通过分子间二硫键形成大聚体，影响面团的弹性和强度。麦谷蛋白按其分子量大小又分为高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunits，简称HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(low molecular weight glutenin subunits，简称LMW-GS)，二者是面筋蛋白的主要成份，与小麦的加工品质密切相关，赋予面团弹性，共同决定小麦面粉加工品质。

高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因拷贝数较少，分子量较大，易于通过SDS-PAGE进行鉴定，其等位基因变异与小麦品质的关系已经得到了广泛深入的研究。LMW-GS基因大多数被定位到第一同源群1A、1B和1D染色体的短臂末端，命名为Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点，其基因的拷贝数目前尚不清楚。通过Southern印迹分析，在六倍体普通小麦中LMW-GS基因的拷贝数可能为10-15个，也有研究认为可能为35-40个。LMW-GS基因没有内含子，是一个单一的开放阅读框，其编码序列一般含有900-1200个碱基，其编码的成熟蛋白亚基的分子量大小约30-45kDa。一般而言，LMW-GS可以分成信号肽(20个氨基酸残基)、N-末端区(13个氨基酸残基)、重复区域和C-末端区四个部分，而且C-末端区域可进一步细分为3个区，分别是C-I区、C-II区和C-III区(图1)。

由于低分子量麦谷蛋白亚基对小麦面粉加工品质的形成具有重要作用，对其编码基因的数目和组成的探索一直是小麦品质改良课题的研究热点。对LMW-GS基因的分离和克隆，早期是通过探针杂交筛选文库的方法获得的。随着PCR技术的发展，同源基因克隆作为一种快速可靠的方法，在小麦及其近缘物种的LMW-GS基因研究中得到广泛应用。Zhao等分析了多个小麦品种Glu-D3位点的基因组成，发现在一个品种中存在6个编码基因；Wang等对Glu-B3位点基因的分析，发现了4个编码基因，共有17种单体型；而Zhang等对Glu-A3位点编码i类蛋白的基因做了分析，但是对基因和单体型的数目并未形成具体的结论。随着基因文库技术的发展，对LMW-GS基因的组成有了更深入的研究。Ikeda等利用cDNA文库的筛选和常规PCR的方法从Norin61中分离得到了12类LMW-GS基因，并利用中国春缺四体将这些基因分别定位到了Glu-A3(3类)、Glu-B3(2类)和Glu-D3(7类)位点上。Huang等利用BAC文库筛选的方法，从Glenlea中分离得到了19个LMW-GS基因，其中12个基因具有完整的开放读码框，染色体定位分析表明，1个基因位于Glu-A3位点(EU189087)，2个基因位于Glu-B3位点(EU189088and EU189089)，而Glu-D3位点有9个基因(EU189090-EU189098)。以上研究极大地丰富了人们对低分子量麦谷蛋白亚基基因组成的认识。但是，由于LMW-GS基因数目较多，常规同源克隆的方法具有很大的盲目性，而且操作繁琐；而文库构建和筛选的方法则工作量太大，效率低。目前为止，尚没有简便有效的方法分离鉴定LMW-GS基因，无法明确LMW-GS基因的数目和组成，这极大地阻碍了对不同LMW-GS与面粉品质形成之间关系的研究。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种一种辅助检测目的基因家族的基因种类的方法。

本发明所提供的辅助检测目的基因家族的基因种类的方法，包括如下步骤：