[发明专利]熊果酸的制备方法及其在治疗肿瘤疾病药物中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及熊果酸的制备方法及其用途，具体地说是从白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)全草中提取有效成分熊果酸的方法及其在治疗肿瘤疾病药物中的用途，属于医药技术领域。

背景技术

熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，其分子式为C₃₀H₄₈O₃，分子量456，其化学结构如下：

人们在Oldenlandia diffusa(O.diffusa)，Ligustrum lucidum，Rabdosia rubescens，Prunella vulgaris^[1-3].等多种植物中均发现有熊果酸的分布。但是，传统的分离制备熊果酸的方法如正相硅胶薄层色谱、正相硅胶柱色谱等方法由于固相载体的死吸附使得分离的产率和效率均很低，而发展的高效液相色谱方法仅用于其纯度分析和鉴定，因此，还没有一种能快速高效地大量制备熊果酸的方法。

一系列的研究表明，熊果酸具有强的抗肿瘤活性，也具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料^[4-10]。但对于熊果酸在治疗肿瘤多药耐药的研究报道很少，特别是对于其通过AIF介导的caspase非依赖的细胞凋亡途径克服肝癌多药耐药性的研究还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速、高效、大量制备熊果酸(Ursolic acid)的方法。本发明的另一个目的是提供熊果酸在治疗肿瘤多药耐药性药物中的新用途。

熊果酸分子式为C₃₀H₄₈O₃，分子量456，CAS nmuber：77-52-1，属于三萜酸类化合物。其制备方法步骤如下：

将白花蛇舌草全草用乙酸乙酯提取，所得的浸膏进行正相柱及RP-C₁₈反相柱色谱分离，接着采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂体系进行逆流色谱分离，收集目标物质，挥发溶剂后得白色结晶性粉末，即为目的化合物熊果酸，所说的逆流色谱分离体系中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为5∶4∶5∶4。

本发明的熊果酸在治疗肿瘤疾病药物中的用途，是在制备通过AIF介导的Caspase非依赖的细胞凋亡途径克服肝癌多药耐药性的药物中的应用。

采用本发明方法制备得到的熊果酸可以按照药学领域的常规生产方法制成以下制剂形式：包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。熊果酸可以作为单味制剂，也可以包含其它的增效剂，组合成抗肿瘤药物。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用吸附柱色谱和逆流色谱相结合的制备技术制备熊果酸。首先利用柱色谱的初级分离能力将含有熊果酸的白花蛇舌草提取物进行粗分，然后再利用逆流色谱制备技术的制备，具有效率高、样品无损、快速、高收率、高纯度等优点。

(2)本发明制备的熊果酸抗肿瘤药物，具有体外强烈抑制耐药株肿瘤细胞增殖的作用，经四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测，对人肝癌多药耐药株细胞R-HepG2的半数抑制增殖率IC₅₀约为9.75μg/ml。而且体内外实验发现熊果酸能通过AIF介导的caspase非依赖途径这一机制诱导多药耐药性肝癌细胞R-HepG2死亡，但并不会对小鼠的机体产生明显的毒性。因此其作为单味制剂或与药物敷料组合，均可在制备治疗耐药性肿瘤药物中应用。本发明为进一步新的抗恶性肿瘤多药耐药药物提供了科学依据，对开发利用我国传统中药具有重要意义。

附图说明

图1为熊果酸的¹HNMR谱图；

图2为熊果酸的¹³CNMR谱图；

图3为熊果酸的ESI-MS谱图；

图4为熊果酸的液相色谱分析结果；

图5UA对R-HepG2细胞的增殖抑制作用。

图6为熊果酸作用于耐药株细胞R-HepG2的细胞周期图。

图7为熊果酸不同时间、不同浓度作用于乳腺癌Bcap37的AnnexinV-PI双染凋亡图。

图8为加入caspase抑制剂后熊果酸对耐药株细胞R-HepG2凋亡诱导率的柱状图；

图9为为熊果酸引起耐药株细胞R-HepG2凋亡的荧光图。

图10为加入或不加入caspase抑制剂，熊果酸对R-HepG2细胞线粒体膜电位的作用结果。