[发明专利]伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及伤寒沙门菌检测领域，尤其涉及一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

伤寒和副伤寒是我国法定乙类传染病，伤寒是由伤寒沙门菌引起的，副伤寒是由甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起的。伤寒引起的急性肠道传染病，目前仍是世界性的主要公共卫生问题之一，尤其在发展中国家。全世界每年约有1700万伤寒热病例，60万人死亡。1990年以后，我国平均发病率在4.08-10.45/10万之间，每年报告5.1-12万人患病，病死33-374人。

目前伤寒、副伤寒现有诊断方法以细菌分离培养、生化鉴定和血清学鉴定为主，需6-7天时间，特别是伤寒、副伤寒的传统血培养分离方法不仅时间长，而且阳性率低，不利于疾病的早期诊断和治疗，易漏诊。近几年来，随着PCR技术和荧光PCR技术的发展，基于核酸水平的检测方法逐渐开发。目前国内只有采用普通PCR同时检测伤寒和甲型副伤寒的报道，国外有利用多重PCR检测伤寒、甲型和乙型副伤寒的报道，以及利用TaqMan探针的荧光PCR技术检测伤寒沙门菌的报道，近期有用TaqMan荧光PCR检测丙型副伤寒和猪霍乱的报道。

但目前报道的荧光PCR技术一般都是单管检测1种伤寒沙门菌，未见利用改良分子信标荧光探针结合HAND系统的多重荧光PCR技术1管同时检测伤寒、甲型、乙型和丙型副伤寒的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检 测试剂盒，该试剂盒可应用于一般标本的伤寒、副伤寒沙门菌初筛检测，其操作简便、结果客观准确。

本发明的第二个目的在于提供一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：

特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；

用于检测甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

用于检测乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物，其碱基序列如SEQID NO：10和SEQ ID NO：11所示；

用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其碱基序列如SEQ IDNO：12所示。

所述用于检测伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因、甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因、乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团FAM，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

所述用于检测沙门菌ssaR基因的分子信标探针，其5’端标记荧光基团HEX，其3’端标记淬灭荧光基团DABCYL。

一种利用多重荧光PCR检测伤寒、副伤寒沙门菌的方法，包括以 下步骤：

1)提取样本DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用特异性扩增伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌ViaB基因序列的加尾引物PCR扩增ViaB基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；利用特异性扩增甲型副伤寒沙门菌fliC-a基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-a基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；利用特异性扩增乙型副伤寒沙门菌fliC-b基因序列的加尾引物PCR扩增fliC-b基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；利用特异性扩增沙门菌ssaR基因序列的加尾引物PCR扩增沙门菌ssaR基因，加尾引物碱基序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；

3)用以下分子信标探针与步骤2)所述PCR扩增产物杂交，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，

Ct≤32：阳性，