[发明专利]多种小分子化合物的同步间接竞争免疫检测法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微球的小分子多残留荧光免疫检测方法，特别是涉及一种以藻红蛋白为荧光标记物、聚苯乙烯荧光编码微球为固相载体的间接竞争免疫检测法及使用的试剂盒。

背景技术

食品中的兽药、农药、添加剂等小分子残留物问题是影响民生的重大问题，已成为国内外广为关注的食品安全问题之一。目前检测常用的方法主要包括：微生物法、色谱法(如高效液相色谱法，HPLC)或色谱-质谱联用技术(如液相色谱-质谱串联法，LC-MS)；酶联免疫吸附法(ELISA)。微生物检测法操作简单，但检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术灵敏度高，结果可靠，但测定方法繁琐、费时，成本高，操作人员需要经过专业培训，难以普及。ELISA法是利用酶标记物的竞争性免疫检测方法，近年来被广为用作定性或半定量检测的快速筛查方法，在一定程度上缩短了检测时间，但是一次只能检测一种靶标物，不利于大量样品的快速筛选。

悬液芯片(又称悬浮芯片、液相芯片)系统是上世纪90年代中期新兴的一种多功能、高通量的液相分析平台，该系统主要基于流式荧光编码微球为载体和荧光探针进行免疫检测，检测通量大、灵敏度高，可实现同步检测多靶标，理论上可检测100种靶标物。该技术最先被应用在细胞、基因、抗体、病毒检测等基因研究与生物医疗诊断领域，后来延伸到动植物中病毒等的检测与监控。近几年，人们继续拓展该平台的应用领域，希望能将该项技术应用到小分子残留物的检测，从而能达到对小分子有害残留物的及时发现和监控管理。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微球的间接竞争荧光免疫检测法，实现用不同的编码微球和同一种荧光探针可同时检测同一样品中多种小分子化合物抗原成分或者同时检测多个样品中的不同种小分子化合物抗原成分。

本发明的进一步目的是提供了一种在此检测方法过程中使用的检测试剂盒。

本发明是以藻红蛋白进行荧光标记，应用于抗原抗体特异性竞争反应的一种荧光免疫检测法，由于微球根据内部包埋荧光染料的比例不同进行编码，选用不同编码的微球作为固相载体，连接不同的捕获抗原，然后进行混合，在96孔滤膜板上进行反应，可以克服ELISA只能检测单一靶标物的缺点，可同时检测同一样品中多种待测小分子抗原，或者在不同微孔板中检测不同样品中的单种或多种待测小分子抗原，旨在提高检测通量，提高检测速度。

本发明的技术解决方案如下：

首先，将合成的蛋白偶联抗原作为捕获抗原包被在聚苯乙烯微球上，形成微球-捕获抗原偶联物，在96孔滤膜板上，微球-捕获抗原偶联物与待测物中小分子抗原竞争与检测抗体发生特异性反应，其中，与小分子抗原结合的检测抗体经洗涤抽滤而被从反应体系中去除，而与微球-捕获抗原偶联物反应的检测抗体与后续加入的荧光探针(如藻红蛋白标记的二抗)进行特异性结合形成微球-捕获抗原-检测抗体-二抗-藻红蛋白荧光免疫复合体，经仪器检测荧光信号便可完成检测过程。

所述的蛋白偶联抗原，即捕获抗原，是指将不具备免疫原性的小分子化合物与大分子载体蛋白进行合成，其中大分子载体蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)，也可以是卵清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)。

所述微球-捕获抗原偶联物是指使用碳二亚胺法，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)活化微球表面的羧基官能团，然后与捕获抗原上的氨基反应，从而以共价键方式形成微球-捕获抗原偶联物。

所述检测抗体是指抗捕获抗原也即抗待测小分子抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，检测抗体可与微球-捕获抗原偶联物发生特异性反应，如果体系中有待测抗原存在则待测抗原也会竞争性地与检测抗体发生特异性结合。

所述藻红蛋白标记的二抗是指用藻红蛋白作为荧光探针标记的抗单克隆抗体或多克隆抗体的二抗。

所述微球-捕获抗原-检测抗体-二抗-藻红蛋白荧光免疫复合体，是指在待测抗原与捕获抗原竞争与检测抗体发生反应结束后，加入的藻红蛋白标记的二抗与微球-捕获抗原-检测抗体复合物进行继续特异性反应生成的复合物，而待测抗原-检测抗体复合物与藻红蛋白标记的二抗如果发生反应生成的复合物则会通过洗涤而用96孔滤膜板的抽滤离开反应体系。

所述96孔滤膜板是指框架与常规酶标板一致，板底使用亲水性滤膜进行替代的反应板，使用的滤膜孔径小于微球粒径，未与微球-捕获抗原结合的荧光免疫复合物则可以透过滤膜，经真空抽滤后从反应体系中被去除。