[发明专利]一种提高变构霉素发酵产量的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种提高变构霉素发酵产量的制备方法，特别涉及一种在以放线菌发酵培养生产变构霉素时补加前体物质来提高变构霉素发酵产量的工艺方法。

(二)背景技术

变构霉素(Tautomycin)是我国著名生物化工学家、中国工程院院士沈寅初院士于60年代末发现的抗生素。于1987年在日本理化所对其结构进行了初步鉴定，1990年对变构霉素进行了完整鉴定，其分子式为C₄₁H₆₆O₁₃。

Tautomycin是Streptomyces spiroverticillatus产生的一种特定的蛋白磷酸酶抑制剂[5]，尤其是对蛋白磷酸酶类型1(PP1)和蛋白磷酸酶类型2A(PP2A)作用明显，其IC₅₀分别是22nM和32nM；它也是一种有效研究细胞内转换信号的介质，具有良好的生物活性和抗真菌活性。它对黄瓜灰霉病有很好的抑制作用，斑点测试剂量为6ppm；对油菜菌核病具有极强的抗菌活性，其最低抑制浓度达到0.5μg/mL。另外还可以在0.03-0.3μg/mL范围内有效抑制人体佛波酯诱导的髓样白血病细胞系HL60的扩散。

介于变构霉素良好的抗菌活性和诸多优点，已经有很多的研究小组对其进行了合成方面的研究。但是自该化合物发现以来。研究人员多数是从化学合成方向生产变构霉素。化学合成方法虽然精度高，但原料有限、有机溶剂污染大、过程繁杂(20多个步骤)以及产量低等都是限制变构霉素大生产重要因素。随着生物技术的发展，生物法生产抗生素显示出了它独特的优点。但是到目前为止，很少有关于生物法生产变构霉素的报导，1987年，Cheng等从16L发酵液中提取得到4.8g油状物，初略地报导了其发酵产量为133.3mg/L。1995年Ubukata等在研究其生物合成途径过程中间接地报导了变构霉素的产量为91.8mg/L。而在补料发酵方面自今未见有报导，补料发酵是提高抗生素产量的一种很有效途径。因此，我们希望以补料的方式提高变构霉素的产量。

变构霉素化学结构中含有一个独特的酸酐结构，1995年Ubukata等利用13C研究了变构霉素生物合成过程的中间体。因此，我们试图通过补加这些中间物质来提高变构霉素的产量。最终发现，在其发酵液中添加一定量的前体类物质可以在一定那个程度上提高变构霉素的产量。其中尤其是具有与变构霉素相同酸酐结构的顺丁烯二酸酐对其发酵的影响较大，可以大大提高变构霉素的产量。然而顺丁烯二酸酐水溶液成酸性，在发酵补加过程中对发酵液的pH也有很大影响。如果补加速度过快、或者浓度过高都会导致发酵液pH成较强的酸性，最终使菌体溶解死亡。因此，补料过程流速、浓度的控制必须严格控制发酵液pH。另外，变构霉素属于次级代谢产物，对前体类物质的利用一般发生在产物合成期，即发酵后期。因此，前体物质补加的最佳时间也在发酵的中后期。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种通过发酵的方法制备变构霉素提高变构霉素产量的方法，本发明在发酵过程中适时地补加前体物质，最终可以使变构霉素产量得到大幅度的提高，可以很好地改善发酵生产变构霉素产量过低的现状。

为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

一种提高变构霉素发酵产量的制备方法，所述工艺方法包括如下步骤：

(1)将放线菌菌种接入种子培养基，于27～30℃摇瓶培养20～26h后得种子液，再取种子液，接入发酵培养基在26～35℃温度条件下进行发酵培养；

(2)发酵培养50～90h后，发酵液的pH升至4.5～7时，补加前体物质，这里pH升至4.5～7的含意是pH升至4.5或无限接近于7但不到7；通常是待发酵液pH从最低值上升至4.5～6.5时开始缓慢补加低浓度的前体物质效果较好；所述前体物质的补加总质量为所述发酵液的0.1％～0.3％g/mL；所述前体物质为单一下列物质之一或是按顺序补加下列任意几种物质：顺丁烯二酸酐、甘氨酸、蛋氨酸、α-酮戊二酸、丁二酸盐、丙二酸、柠檬酸、谷氨酸或2，3-二甲基马来酸酐，补加后在27～30℃继续发酵10～30小时，所述补加前体类物质以水溶液的形式加入，所述的前体类物质水溶液的浓度为10～80g/L，流速为0.2～0.8mL/min，且继续保持发酵液pH在4.0～7.0之间；