[发明专利]菠萝蔗糖合成酶基因Ac-Sy1、编码蛋白质以及其基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因及其克隆方法，同时涉及基因的编码蛋白质，具体涉及一种菠萝蔗糖合成酶基因Ac-Sy1、编码蛋白质以及基因克隆方法，属于生物技术领域，具体涉及到果实品质改良的基因研究领域。

背景技术

蔗糖合成酶(SS)是一种存在于细胞质中的可溶性酶，由分子量为83～100kD的亚基构成的四聚体，蔗糖合成方向最适pH值在8.0～9.5，蔗糖裂解方向最适pH值5.5～6.5，催化如下可逆反应：Suc+UDP←→Fru+UDPG，它在蔗糖代谢中是起合成还是分解的作用与其酶蛋白是否被磷酸化有关(Amor等，1995；Tanase和Yamaki，2000；Tanase等，2002)。由于蔗糖合成酶具有分解和合成蔗糖的双重属性(龚荣高等，2004)，所以在调控蔗糖代谢中可能起更重要的作用，在缺少转化酶的情况下，SS分解方向是催化蔗糖分解的关键酶，维持其质量浓度的平衡具有重要意义。不同种类的果实，蔗糖合成酶在糖积累中的作用也有差异，并且决定了果实中积累的糖的成分。

梨(Moriguchi等，1998)、‘红富士’苹果(王永章和张大鹏，2001)、‘糯米糍’荔枝(王惠聪等，2003)果实糖的积累主要受SS活性的调控。桃果实成熟过程中SS活性与蔗糖的积累呈显著正相关(范爽等，2006)。栽培型番茄中也发现，果实发育前期，SS活性与淀粉和果糖的含量呈显著正相关(刘以前等，2006；齐红岩等，2006)。在番茄果实发育早期，改变SS活性直接影响果实干物质的积累速率和蔗糖分解指数，转入反义SS基因明显抑制花和果实中的SS活性，SPS活性也同时随着降低，番茄幼果中淀粉积累减少，幼果中蔗糖的卸出能力下降。这说明SS直接影响到幼果中蔗糖的输入能力(D’Aoust等，1999)。在葡萄柚果实从细胞活跃期到膨大中期，汁囊中SS的合成活性逐渐升高，而分解活性迅速降低，在各组织中，维管束和维管束卸出区SS活性最高，表明在维管束组织中SS具有重要的生理功能(Lowell和Tomlinson，1989；Nolte和Koch，1993)。

甜瓜上研究发现，甜基因型的品种比不甜基因型的品种积累的糖更多，这证实了糖积累主要受基因型的控制(Hubbard等，1989)。酶基因的研究大多从克隆开始。目前国外研究者已经成功地将SS基因从梨、桃、番木瓜、马铃薯、胡萝卜、玉米、甘蔗等作物中克隆出来。雷美华等(2008)所克隆的甘蔗蔗糖酶合成基因SuSy2，该基因全长约为7.5kb，与Lingle等(2001)报道的甘蔗蔗糖合成酶(SuSy2)基因序列相似性达到99.15％，推导的氨基酸序列同源性达到100％。该序列包含约119kb的上游启动子调控区域，16个外显子，15个内含子，3′不翻译区，开放读码框(ORF)编码802个氨基酸，氨基酸序列中存在糖代谢关键酶家族保守的14-3-3蛋白磷酸化位点Ser/Thr。

目前在柑橘、番茄、咖啡、玉米和棉花等作物中有许多有关蔗糖合成酶的基因克隆和表达的研究，但在菠萝研究领域中仍属空白。菠萝的SS基因的获得，能够为下一步菠萝品质改良的研究奠定良好的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菠萝果实蔗糖合成酶基因Ac-Sy1的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1，含360bp。

本发明的另一个目的是提供一种菠萝果实蔗糖合成酶基因Ac-Sy1编码的蛋白序列，含120个氨基酸残基，位于糖基转移酶结构域内，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

同时，本发明还提供该蔗糖合成酶基因Ac-Sy1的克隆方法。

本发明所提供的蔗糖合成酶基因，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-Sy1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

上述菠萝蔗糖合成酶基因Ac-Sy1编码的蛋白质，来自菠萝(Ananas comosus)，命名为Ac-Sy1蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

上述菠萝蔗糖合成酶基因Ac-Sy1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)选用菠萝果实作为实验材料，采用改良SDS法提取菠萝果实中的总RNA，RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)以获得的总RNA为模板，采用Takara公司生产的mRNA Selective PCR Kit Ver1.1进行反转录获得cDNA。