[发明专利]一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法

说明书

技术领域

本发明属反硝化菌的筛选纯化领域，特别是涉及一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法。

背景技术

随着工业废水和生活污水的大量排放，水体富营养化日益严重，高效去除水中氮素污染成为当今的一个热点问题。氮污染主要来源为城市污水、工业废水、畜禽养殖废水、垃圾填埋渗滤液等，污染物持续进入水体，造成水生植物和藻类过度生长，同时藻类产生的毒素引起引起鱼和其他水生需氧动物死亡。传统理论认为反硝化是一个严格的厌氧过程，而自20世纪80年代首次发现好氧反硝化菌后，好氧反硝化菌的分离及其性能研究迅速发展，国内外最近报道的有戴尔福特菌属(Delftia)，沙门氏菌属(Salmonella)和假单胞菌属(Pseudomonas)等。C.W.Lindau和M.Robert Hamersley等则分别证实了河流和湖泊等地表水中，都存在着大量的反硝化菌和厌氧氨氧化细菌，而苏州河是上海市内重要的水体功能地表水，但由于其接纳的污水量大，污染负荷远远超过自净能力，水质受到严重污染，各种水体功能也因此受到损害，因此在污染较严重的地段能筛选出高性能的反硝化菌种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，该方法简单，成本低，材料来源广泛，适合于共业化生产；所得解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiellaornithinolytica)反硝化效率可达87.6％，且易于灭活，保证了使用的生态安全性。

本发明的一种解鸟氨酸克雷伯菌的反硝化筛选纯化方法，包括：

(1)将污水按1∶100的体积比接入富集培养基，于30℃，110r/min摇床中富集培养24h；

(2)将步骤(1)富集培养后的菌株用稀释平板涂布法转接至固体分离培养基，置于30℃恒温培养箱培养24～48h，经过3次划线分离得到纯化菌种；

(3)将纯化菌种富集后，按18～23％的接种量接种到液体分离培养基，测试菌株在30℃、好氧条件下培养24h时的反硝化率，筛选出反硝化率达75％以上的单一菌株，转接斜面培养基，4℃下保存。

所述的污水取自苏州河。

所述步骤(1)中的富集培养基为：蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH 7.4-7.6；固体培养基中加入18g/L的琼脂粉。

所述步骤(2)和(3)中的分离培养基为：碳源3～5g，KNO₃2g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，CaCl₂0.02g，定容到1000ml，调节pH 7.4-7.6；固体培养基另外加1.8％W/V琼脂。

所述的碳源为乙酸钠、丙酸钠、乙醇、谷氨酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、甲醇、硫代硫酸钠、葡萄糖或碳酸氢钠。

所述的碳源为葡萄糖，在分离培养基中的用量为5g，培养基初始pH值为7.5。

所述步骤(3)中的菌株为较短粗的杆菌，单独排列，无芽胞，无鞭毛，长度约0.8-1.5微米，直径约0.3-0.6微米；菌落呈灰白色，圆形；革兰氏染色呈阴性。

所述菌株经16S rDNA序列测定和分析比较，鉴定为解鸟氨酸克雷伯菌，命名为Klebsiella ornithinolytica N-4，同源性达到97％。

本发明为污染治理提供了新的方法。

有益效果

(1)本发明的方法简单，成本低，材料来源广泛，适合于工业化生产；

(1)本发明所得的解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4具有较高的反硝化作用，反硝化效率可达87.6％；菌株在好氧的条件下具有良好效果，能适应复杂的实际条件，在培养基上能存活数周至数月；解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的种源为苏州河污染严重的路段，解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4对一般抗生素均无抗性，且易于灭活，55℃30分钟即可杀死，保证了使用的生态安全性。

附图说明

图1为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的系统进化树；