[发明专利]通过PCR模拟和双S形方程式确定单峰熔解温度

说明书

发明背景

本发明一般地涉及到代表寡聚核苷酸熔解特征的数据处理，并且更具体地涉及以熔解曲线数据为基础的确定寡聚核苷酸样品的熔解温度的系统和方法。

熔解温度的确定是一种区分基因型的重要方法。在确定DNA或寡核苷酸熔解温度的典型单步、均质、封闭管法中，双链特异性DNA染料(例如，SYBRGreen I，分子探针，Eugene，Oregon)或标记的寡核苷酸被用于在实时PCR中监测产品的形成(Wittwer CT，et al.，BioTechniques 1997；22：130-8)和熔解温度(Ririe KM，et al.，Anal.Biochem 1997；245：154-60)。通常，使用热稳定酶和至少一对寡核苷酸引物来进行扩增，该热稳定酶对于DNA变性温度是稳定的。在某些实施方案中可使用一个或更多个额外的寡核苷酸引物(例如用于扩增多于一个DNA座位或多于一个基因型)。特别地，均质的并且不需要在扩增开始之后添加试剂或对以分析为目的的反应进行物理抽样的荧光技术是吸引人的。示例性的均质技术使用用以定位目标区域的寡核苷酸引物，和用于产生信号的荧光标记或染料。典型的基于PCR的方法使用带有两个互相作用的发色团的FRET寡核苷酸探针(相邻杂交探针，TaqMan探针，分子信标，Scorpions)，带有单独一个发色团的单寡核苷酸探针(G-猝灭探针，Crockett，A.O.and C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；290：89-97和SimpleProbes，Idaho Technology)，以及使用dsDNA染料(比如SYBR Green I)代替共价荧光标记的寡核苷酸探针的技术。

确定寡核苷酸或DNA熔解温度的典型方法包括扩增目的核酸的一部分和随后确定扩增子的熔解温度。在后面一步中，待分析样品的温度改变(比如提高)通常为一定温度范围内部分度数，并测量荧光的改变。在熔点时，DNA的两条链将分开，荧光迅速减弱。相对荧光单位(RFU)与时间(T)的变化比率(-d(RFU)/dT)被标绘在Y轴，与X轴上的温度相对。通常，熔解温度的确定在扩增步骤之后直接进行。在某些实施方案中，熔解温度的确定可能在扩增反应过程中就已经进行了。

确定寡核苷酸或DNA熔解温度，通常在PCR试验以后直接进行，是辨别基因型的一种重要方法。一些方法需要确定多重熔解温度以从突变基因中鉴定野生型。作为选择的，熔解方法能在峰高的基础上用于单个基因型定量确定基因数量。例如，最近有文献报道检验KRAS基因可确定哪些患者可能是非小细胞肺癌治疗的候选者。KRAS基因是野生型的患者将从治疗中获益，然而，如果患者的这一基因突变变异，治疗将是毫无益处的。由于这些治疗往往有很大的副作用，确定患者正确的基因型就非常重要。这也可以用于了解目前基因的数量。

因此，提供准确、有效的确定DNA样品的熔解温度和以峰高为基础确定基因数量的系统和方法是人们所希望获得的。

发明概述

本发明提供基于熔解曲线数据确定寡核苷酸的熔解温度，Tm的系统和方法。所述的系统和方法也允许基于峰高的基因数量的定量确定。

按照不同的实施方式，PCR模拟被用于完成获得的熔解曲线数据集的量化。在某些方面，所述熔解曲线利用水平翻转和水平平移变换。双S型方程式然后拟合所述数据。接着逆平移和逆水平翻转变换被应用到所述方程式中以产生基于方程式的所述熔解曲线数据集的解析。基于方程式的融解曲线的解析被用于确定一阶导数(例如，Tm值)和峰高。