[发明专利]植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病菌检测，特别是一种植物种子携带细菌性黑斑病菌快速检测的方法。

背景技术

十字花科细菌性黑斑病是由丁香假单胞杆菌斑点致病变种引起(Pseudomonas syringaepv.maculicola)，属于原核生物细菌界，变形杆菌门，假单胞菌科。该菌短杆状，大小为1.3-3.0μm×0.7-0.9μm，有1-5根极生鞭毛，革兰氏染色为阴性。寄主主要是十字花科蔬菜，如白菜、花椰菜、萝卜等，同时也可为害辣椒、番茄。

Pseudomonas syringae pv.maculicola是一种特殊的变种，同其他丁香假单胞杆菌有较接近的营养需求、致病性和相似的起源，特别是与引起番茄细菌性病害的丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)在营养条件、致病性和遗传特征上有着相似性，寄主范围重叠，所以在研究初期很难将它们区别开，传统的细菌鉴别方法如选择性培养基筛选基本不起作用。

目前较为常见的丁香假单胞菌斑点致病变种鉴定方法有脂肪酸分析、LOPAT测试、Biolog-GN板测试碳源氧化利用、rep-PCR基因指纹分析、RFLP技术、DNA配对分析、RAPD和AFLP技术等。脂肪酸分析表明丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)、大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)和斑点致病变种的相似系数最接近，不易鉴别。而LOPAT测试、Biolog-GN板测试碳源氧化利用和rep-PCR都可用来鉴定丁香假单胞菌斑点致病变种。碳源氧化的聚类分析得出丁香假单胞菌斑点致病变种和番茄致病变种被列入了同一组，相似性为79.5％，但通过碳源氧化GN数据无法区分这2个菌。rep-PCR遗传指纹分析有利于快速鉴定分离菌株，对丁香假单胞菌斑点变种的鉴定也较为准确。除了丁香假单胞菌番茄致病变种的DC3000菌株和OH314菌株的表型识别与斑点致病变种的相似外，番茄致病变种的其他菌株可以通过rep-PCR与斑点致病变种区分。RFLP技术也可来分析细菌种类和致病变种的亲缘关系。

防治十字花科细菌性黑斑病最经济有效的方法之一就是播种无菌种。种子带菌检测需要快速、可靠、灵敏的检测方法。近年来人们主要应用PCR的方法来对病菌进行鉴定和检测。PCR方法敏感度高，特异性强，操作简单方便，并且PCR产物的生成以指数方式增加，能将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。所以理论上它可对单拷贝基因、单个病菌等微量标本进行分析。但在种子带菌检测方面，PCR技术也有其不可否认的局限性，如直接将样品浸泡液加入反应体系，由于种子浸泡液中含有病原细菌浓度较低，反应体系小，就有可能未使病原菌参与到PCR反应中，造成PCR反应假阴性。

磁性免疫微球(immunomagnetic microsphere-IMMS)是近年发展起来的一类新型功能性材料，它是磁性微球(magnetic microsphere-MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小，比表面积大，故而偶联容量较高，悬浮稳定性较好，便于各种反应高效而方便的进行；又因其具有顺磁性，在外电场的作用下固液相的分离十分简单，可省去过滤、离心等繁杂操作，并可在磁场作用下定位，方便地进行分离同配体相对应的物质。

目前在植物病原菌检测领域所使用的Real-time PCR(实时定量PCR)主要是应用TaqMan水解探针作为荧光基质的Real-time PCR系统。在TaqMan系统中，使用一个寡核苷酸探针序列一般长度为25～30核苷酸，其5′末端有一个荧光报告集团，通常为6-羟基荧光素(6-FAM)。3′端有一个荧光淬灭集团，通常为6-羟基-4-甲基若丹明(TAMRA)。当探针完整时，由于淬灭荧光集团与报告荧光集团彼此接近，可以极大地减少后者发射出的荧光。在反应的每个循环，当没有与探针互补的目的序列存在时，探针保持游离。由于TaqDNA聚合酶的5′核酸外切酶活性是双链特异性的，游离的单链探针仍保持完整时的荧光信号不变。当有相应的扩增产物出现时，探针在PCR的变性阶段可与其杂交。当TaqDNA聚合酶引导引物向下游延伸时，TaqMan探针因5′-3′外切酶活性而被水解(切口平移效应)，荧光集团被释放，从而产生荧光，荧光信号就可以被仪器检测。

发明内容