[发明专利]重组人血清白蛋白-干扰素α1b融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明一般的涉及重组人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，特别地涉及重组人血清白蛋白-干扰素及其制备方法。 

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是一类重要的家族性细胞因子，具有抵抗病毒感染，抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为3型：I型包括IFN-α，-β，-ω，-ε，-κ等亚型；II型干扰素由单基因家族IFN-γ构成，又称为免疫干扰素；III型是一种新发现的细胞因子，称为IFN-λ。其中IFN-α的抗病毒活性最强，IFN-α分子的不同亚亚型由165-172个氨基酸组成，分子量约19kD左右。随着基因工程技术的发展，IFN-α成为第一个用于临床的基因重组细胞因子，已经被美国FDA批准应用于病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等多种疾病的治疗。但是干扰素分子量较小，易被肾小球滤过，体内不稳定，易被血清蛋白酶降解，血浆半衰期短而治疗周期长，需要频繁注射给药，患者依从性降低。 

为了克服上述缺点，长效干扰素药物开发已成为一个重要方向。延长重组干扰素半衰期有以下几种有效方式：1)缓控释制剂，干扰素包封于聚合层中，通过皮下或肌肉给药，聚合层随时间减少，使药物从微囊中缓慢持续释放，这有利于稳定药物，减少胃肠道酶的破坏，延长药物体内半衰期；2)利用定点突变技术，如寡核苷酸引物、PCR介导的定点突变及盒式突变等方法使干扰素中蛋白酶位点改变成对蛋白酶不敏感的其他氨基酸，从而减少血液中的酶对其降解，延长体内半衰期；3)化学修饰技术，将糖基或PEG等共价链接到干扰素表面，使蛋白相对分子量增大，减少了肾小球的滤过，保护蛋白不被蛋白酶降解，同时挡住蛋白表面的抗原决定簇，降低免疫原性；4)蛋白融合技术，通过基因重组手段将干扰素基因与特定的载体蛋白基因融合，由同一调控序列控制基因表达产物，用基因工程手段人工创造的新分子。目前为使蛋白获得长效的目的采用最多的载体是HSA和抗体Fc片段。 

由于缓释给药系统存在包封率低，突释和释放不完全以及在制备过程强烈的物理、化学变化导致的IFN变性失活等问题，要制备理想的干扰素缓释制剂还需要大量研究；目前FDA已批准两种PEG化干扰素用于临床，分别是先灵葆雅的PEG-Intron(branchedPEG40kD-IFN-α2b)和罗氏的Pegasys(linear PEG12kD-IFN-α2b)。然而，这两种PEG化干扰素均为非均一产物。PEG-Intron是由14种单修饰和少量未修饰的IFNα-2b组成的混合物，而Pegasys为至少由6种单修饰的组成的混合物，这种众多异构体混合物造成不同的生理反应，同时也导致了产品质量控制、工业化生产纯化等难题。定点突变技术对蛋白质工程技术要求 相当高，类似于组合化学库筛选技术且其延长半衰期的效果并不理想。因此基于基因工程手段研制的长效蛋白药物越来越受到人们关注，这其中以人血清白蛋白融合技术最为突出，该方法以人血清白蛋白为载体。人血清白蛋白(HSA)是人体血液中天然的物质输送载体，血清中含量最高，其相对分子量约为65kDa，是由585个氨基酸组成的单链球型蛋白质，无酶学及免疫学活性，体内半衰期长达19天，是理想的改善药物半衰期的药物融合蛋白。 

发明内容

本发明的首要目的是提供一种人血清白蛋白-干扰素α1b，其具有SEQ ID No.1所示的序列。 

本发明的第二个目的是提供SEQ ID No.1所示人血清白蛋白-干扰素α1b的制备方法，该方法至少包括如下步骤： 

(a)重组人血清白蛋白-干扰素α1b融合蛋白表达基因的密码子优化及化学合成； 

(b)含(a)所述表达基因的酵母表达质粒的构建； 

(c)含(b)所述表达质粒的毕赤酵母转化体的构建及筛选； 

(d)转化体工程菌的发酵培养； 

(e)工程菌表达融合蛋白的纯化。 

上述方法中步骤(a)中的密码子优化优选酵母偏爱的密码子。 

步骤(c)中的毕赤酵母优选毕赤酵母GS115。 

步骤(e)中融合蛋白优选分泌型表达，优选通过人血清白蛋白的天然信号肽实现。 

步骤(e)优选包括： 

(1)对(d)所得工程菌进行离心处理后将所得离心上清液进行超滤浓缩； 

(2)超滤浓缩液的Blue Sepharose FF染料亲和层析纯化； 

(3)前步所得洗脱液的CM Sepharose FF阳离子交换层析进一步纯化。