[发明专利]一种新的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种新的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其应用。 

背景技术

生物被膜(biofilm)是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构。一旦形成生物被膜，细菌将具有极强的抗生素耐药性(比浮游细菌高100-1000倍)和逃避机体免疫系统攻击的能力。牙菌斑生物被膜是牙周病的始动因素，在牙菌斑生物被膜的刺激下，牙周组织细胞分泌的细胞因子在牙槽骨吸收及牙周软组织破坏的过程中发挥着重要作用。然而，目前绝大多数研究集中在浮游细菌对牙周组织细胞毒性的研究，而关于细菌生物被膜与牙周病的研究极少。伴放线放线杆菌是侵袭性牙周炎的主要致病菌，它产生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物被膜的主要成份，在生物被膜形成和致病性方面发挥着重要作用。但目前尚未有能降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶被发现。本发明的发明人从海洋微生物中发现了一种β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1，能降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺，并具有抗伴放线放线杆菌生物被膜的作用。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。 

本发明的另一目的是提供一种上述酶在抗伴放线放线杆菌生物被膜中的应用。 

根据本发明的一个技术方案，从海洋微生物中纯化得到一种新的产N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。 

根据本发明的另一技术方案，使用上述酶对伴放线放线杆菌生物被膜形成进行了抑制，对已形成生物被膜进行了清除。 

本发明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1对伴放线放线杆菌生物被膜形成的抑制作用＞50％，对已形成生物被膜的清除率为74.5％。 

具体实施方式

实施例1菌株的分离和发酵条件 

从黄海采集海泥，样品置于无菌塑料瓶，4℃保存，4h以内用如下方法处理：1mL海泥，加4mL无菌海水，取其悬浮液稀释接入选择性培养基中富集培养。一周后划线于固体培养基培养，经过连续5代挑取单克隆纯化培养后，挑取单克隆接种到含3毫升液体培养基的试管中，25℃200r/min培养12小时。将培养液按1％的比例接入发酵培养基，于25℃150r/min培养3d。4℃12000对min离心10min去除菌体，测定上清液的酶活力，选取酶活力最高的菌株。其中菌株QY403产生的酶活力最高，为4.65U/mL。培养基配方为：每升含β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺3g、KH₂PO₄3g、K₂HPO₄·3H₂O 7g、(NH₄)₂SO₄ 2g、NaCl 30g、MgSO₄·7H₂O 11g、FeSO₄·7H₂O 11g，pH 6.0，100kP灭菌15min。固体培养基中添加1.5％琼脂。酶活力测定方法：200μl底物(1.71g/L 4-硝基苯基-N-乙酰葡聚糖胺)中，加入5μl的酶，40℃保温5分钟，再加入5μl 10M的NaOH中止反应，以0min处底物溶液为空白。迅速测定反应体系在405nm的光吸收值(OD405)。酶活力单位(U)定义为：在以上条件下，每分钟产生1μmol的产物的酶量，定义为1个U。 

实施例2N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1的分离纯化 

(1)细菌培养 

挑QY403单克隆入5ml培养基，25℃150r/min过夜。转接装有100mL培养基的500mL摇瓶(1％接种量)，25℃150r/min振荡培养72小时。4℃离心10000rpm，15分钟，收集细菌发酵液上清液。 

(2)硫酸铵沉淀粗分离 

发酵液上清中缓慢加入硫酸铵至80％饱和度，4℃静置3h；40℃12000g离心30min，弃去上清液，沉淀溶于20mmol/LpH7.5磷酸盐缓冲液，对同样的缓冲液4℃透析过夜；40℃13000g离心30min取上清液，即为粗酶液。 

(3)离子交换层析