[发明专利]融合表达重组制备人β干扰素

说明书

技术领域  本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及通过融合表达的重组人β干扰素，含编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。

背景技术  人β干扰素是成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广泛生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子(KozovsKa ME，et al.Neurology〔J〕，1999，53：1692-1697)，具有5个α螺旋结构和22KDa的分子量(Arduini，et al.Protein Science〔J〕，1999，8：1867-1877)。目前人β干扰素分为β干扰素-1a和β干扰素-1b，其中β干扰素-1a是天然结构，包含有糖基化结构。而β干扰素-1b是将17位的Cys突变成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由165个氨基酸组成(Goodkin DE，et al.Lancet〔J〕，1994，344：1057-1060)。大量研究表明，人β干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达(JacobsL，et al.Curr Opin Neuro〔J〕，1994，7：250-254)。1993年以来国外已批准多种重组β干扰素上市用于治疗多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)。

国外用于临床的IFN-β有IFN-β-1a和IFN-β-1b两种类型，均系基因重组产品。β干扰素作为治疗多发性硬化症的药物已经在国外上市的有先灵公司的Betaferon、诺华欧化公司的Extavia以及雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先灵公司的Betaferon和诺华欧化公司的Extavia属于IFN-β-1b，通过在E.coli中以包涵体形式表达的重组人β干扰素-1b(Ser¹⁷)，工艺中需经SDS变性后再复性。而雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex是通过CHO(Chinese hamster ovary)表达的重组人IFN-β-1a。重组IFN-β-1b和IFN-β-1a在结构与生物活性方面存在明显的差异，主要表现为CHO表达的IFN-β-1a的体外抗病毒比活性高于大肠杆菌包涵体表达制备的IFN-β-1b(Laura Runkel，et al.Pharmaceutical Research〔J〕，1998，15：641-649)。IFN-β-1b在重组制备中需采用SDS进行变性处理后再进行复性，对人体具有潜在的毒性风险。本发明提供了一种制备IFN-β的新方法，实现了人IFN-β经大肠杆菌表达和重组制备中无需SDS变性复性，制备的IFN-β具有更高的体外抗病毒活性。发明目的目前人β干扰素-1b(IFN-β-1b)以包涵体的形式表达，工艺中需用SDS先变性后再复性，制备工艺相对复杂，且含有SDS的残留，其抗病毒比活性仅为2×10⁷IU/mg。

本发明以TRX-Linker-IFN-β融合表达的方式，实现了可溶性形式表达，通过在TRX与IFN-β之间设计不同蛋白酶酶切位点，能高效专一的切除并分离融合蛋白TRX后，再进一步纯化制备重组人β干扰素。为了有利于表达的融合蛋白的纯化，在连接肽中引入6×His标签。工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，通过Ni柱纯化回收融合蛋白，经特定的蛋白酶酶切后通过反相C18柱纯化、离子交换和Superdex-75凝胶柱层析，制备的重组人β干扰素抗病毒生物学比活性达到5.0×10⁷IU/mg以上。

本发明的目的在于提供一种以融合方式表达的重组人β干扰素蛋白并进行有效的重组制备。还提供了编码所述融合表达的人β干扰素蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的提供一种无需复性的制备工艺，获得抗病毒比活性更高的重组人β干扰素的方法。

本发明的另一目的是提供一种可用于治疗病毒性疾病如病毒性丙型肝炎或乙型肝炎，或者免疫性疾病如多发性硬化症的重组人β干扰素。

发明概述  在本发明的第一方面，提供了一种融合表达重组人β干扰素蛋白的上游构建体系，它包括：通过与TRX融合表达的重组人β干扰素，更具体的，该融合蛋白中包含不同的Linker，在Linker中设计不同的蛋白酶酶切位点，包括EK、TEV、thrombin、凝血因子Xa等。还提供了所述人β干扰素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)。