[发明专利]草鱼呼肠孤病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物医药体外分子诊断技术领域，特别涉及到草鱼呼肠孤病毒SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

草鱼出血病(Hemorrhagedisease of grasscarp)是感染草鱼的一种严重的传染性疾病。流行季节长，发病率和死亡率均较高，往往造成大批草鱼鱼苗死亡；1年足龄青鱼也受害，2龄以上草鱼有时也患此病。草鱼出血病的病原出于草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirμs，GCRV)，是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒。草鱼呼肠孤病毒基因组由11条分节段dsRNA组成，总分子量为15.46×10⁶道尔顿，编码了12条多肽，研究表明，各基因组片段与编码多肽的关系是大体一一对应。

目前对GCRV的检测方法包括：免疫学方法如葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(SPA-COA)法、荧光抗体技术(FA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)法和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)法；分子生物学方法如逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。这些方法或者操作繁琐，周期长，或者只能进行定性检测而不能定量分析。最近发展起来的荧光定量PCR技术，以其灵敏度高，特异性好、快速、准确等优点，在病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于草鱼呼肠孤病毒可疑患病草鱼肝、脾、肾组织的草鱼出血病基因诊断的SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案为：

草鱼呼肠孤病毒SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法至少包括：抽提草鱼呼肠孤病毒总RNA、引物设计、草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白基因RT-PCR扩增、草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白基因的克隆与鉴定、标准品模板的稀释和荧光定量PCR反应标准曲线的建立。

草鱼呼肠孤病毒SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的具体步骤如下：

1、采用裂解液和RNA抽提液处理抽提的草鱼呼肠孤病毒总RNA；

2、引物设计：根据GenBank中草鱼出血病-873外衣壳蛋白(VP7)基因序列(AF403396)设计两对特异性引物，扩增片段长度为100bp的片段，所设计的引物如下：

上游引物：5’-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3’

下游引物：5’-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3’；

3、草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因RT-PCR扩增：

取1～10μg病毒总RNA，加入上游引物，进行反转录，取反转录产物cDNA，加入反应缓冲液，dNTPs、上下游引物、灭菌双蒸水，Taq DNA聚合酶，将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，并回收产物；

4、草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因的克隆与鉴定：

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白(VP7)基因扩增产物经胶回收纯化后于14～25℃过夜与载体连接，用连接产物转化感受态细胞，从LB琼脂平板上挑取菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，28～37℃震荡培养过夜，使用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，对重组质粒用上下游引物进行PCR鉴定；

5、标准品模板的稀释：

用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒在260和280纳米处的吸光度，并根据公式计算重组质粒的DNA浓度与纯度，将重组质粒进行10倍梯度稀释，以1×10²～1×10⁸拷贝数/微升作为标准品模板，用于荧光定量PCR反应条件的优化、标准曲线的建立，所用公式如下：

分子拷贝数(个/毫升)＝DNA质量浓度/DNA分子量

DNA分子量＝DNA碱基数×324.5

DNA质量浓度＝260纳米吸光度×50微克/毫升×稀释倍数×6.02×10²³；

6、荧光定量PCR反应标准曲线的建立：

分别以10倍拷贝系列稀释的标准质粒DNA(1×10²～1×10⁸拷贝数/微升)为标准品模板进行荧光定量PCR扩增，每个稀释度做两个复孔，测定该方法的检测灵敏度、分析实验的重复性。

在上述步骤3和步骤5中PCR扩增的反应条件为：

(1)、94℃预变性5分钟；

(2)、94℃变性15秒，50℃退火15秒，72℃延伸20秒，为一个循环，共进行30个循环；