[发明专利]人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒。

背景技术

人流感病毒是一种造成人类患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。

人流感病毒以其核蛋白的抗原性分为A型、B型和C型流感病毒(又称甲、乙和丙型流感病毒)。在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。所以造成大规模流行的一般都为前两种。

流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或儿童及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等。从流行病学的角度来说，流感引起世界性大流行是流感病毒抗原变异与人群免疫屏障相互作用的结果。20世纪全球共出现四次流感大流行，都是由变异的甲型流感病毒引起，造成重大的人员和财产损失。2009年最先由墨西哥发现的新甲型H1N1流感病毒就含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，在全球迅速传播开来，造成大规模的流行。目前全世界各国为防控新甲流H1N1，都在做积极的努力，同时取得了显著的效果。

鉴于甲乙型流感病毒及目前甲型流感中的新甲型H1N1流感病毒对人类所造成的严重呼吸道疾病，特别是在儿童中，为诊治及防控需要，这就需要医疗机构提供准确快速灵敏的检测方法，快速诊断，快速治疗。就目前情况，对甲乙型及新甲型H1N1流感病毒的诊断主要以下几种方法：(1)病毒的培养分离；(2)血清学检测特异IgG及IgM；(3)RT-PCR方法及荧光定量PCR方法。相比较几种方法，前两种方法都是早期开发的经典方法，PCR方法是针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是荧光定量PCR方法的引进，解决了PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具有高特异性、高灵敏度、周期短、操作简单、成本较低等多种优点。

但目前开发的流感病毒分型试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，不能对这三种流感病毒进行同时检测；如要同时检测，则需要分别在三管中进行，其操作繁琐、费时耗力。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测方法，以改进目前现有方法，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。

本发明的人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重荧光PCR检测方法包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其中，多重PCR扩增步骤中采用了序列如下所示的引物(见序列表SEQ ID NO：1-6)：

IFAF：GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC；

IFAR：TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT；

IFBF：CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG；

IFBR：GCTTATGGGAAGCACCACTTTG；

AH1F：GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA；

AH1R：GAGGACATGCTGCCGTTACA。

其中，引物IFAF和IFAR用来检测人甲型流感病毒，我们称之为InfA组引物；引物IFBF和IFBR用来检测乙型流感病毒，本发明中称之为InfB组引物；引物AH1F和AH1R用来检测新甲型H1N1流感病毒，我们称之为A(H1N1)组引物。

上述方法中，还采用了序列如下所示的探针(见序列表SEQ ID NO：7-10)：

IFAP：CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG；

IFBP：CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA；

AH1P：TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA。

优选的，采用Taqman探针检测的荧光定量PCR的反应模式，上述探针的荧光标记具体如下：

IFA-TAMRA：TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2；

IFB-FAM：FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1；

AH1-JOE：JOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。