[发明专利]蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达

权利要求书

1.在丝状真菌细胞中生产蛋白酶抑制剂的方法，所述方法包括

a)将DNA构建物引入丝状真菌细胞，其中所述DNA构建物包含启动子，所述启动子在所述丝状真菌细胞中显示出转录活性，并且所述启动子被可操作地连接到异源DNA序列上，所述异源DNA序列编码包含SEQ ID NO：12的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)，其中残基40-85和/或137-144已经被变异体序列所替换，

b)在适当的培养条件下培养所述丝状真菌细胞，以允许所述异源DNA序列的表达，和

c)产生所述蛋白酶抑制剂；

其中所述变异体序列选自：

由YNLYGWT(SEQ ID NO：77)组成的VEGF结合肽；

由GRKIPIQ(SEQ ID NO：78)组成的补体蛋白c2结合肽；

由ARSNLDE(SEQ ID NO：79)组成的补体蛋白c3结合肽；

由QRALPIL(SEQ ID NO：80)组成的补体蛋白c4结合肽；

由GRLHMKT(SEQ ID NO：81)组成的补体蛋白c5结合肽；

由KRKIVLD(SEQ ID NO：82)组成的补体因子B结合肽；

由AAMFGPA(SEQ ID NO：83)组成的膜金属蛋白酶2结合肽；

由GALGLFG(SEQ ID NO：84)组成的膜金属蛋白酶1 2结合肽；

由EPLIHQR(SEQ ID NO：85)组成的棉花结合肽；以及

由SAFRGPT(SEQ ID NO：86)组成的棉花结合肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括回收所述蛋白酶抑制剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自曲霉属(Aspergillus)菌株、青霉属(Penicillium)菌株、镰孢菌属(Fusarium)菌株或木霉属(Trichoderma)菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述木霉属菌株是里氏木霉(T.reesei)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述曲霉属菌株是黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzea)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码蛋白酶抑制剂的DNA序列包括已经被优化用于在丝状真菌细胞中表达的密码子。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将编码侣伴蛋白的第二个核酸序列引入所述丝状真菌细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述侣伴蛋白是pdiA或prpA。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂被表达为融合蛋白。

10.改变的野生型多核苷酸，其包含已经被优化用于在丝状真菌细胞中表达的密码子，所述密码子编码包含SEQ ID NO：12的大豆胰蛋白酶抑制剂，其中残基40-85和/或137-144已经被变异体序列所替换；

其中所述变异体序列选自：

由YNLYGWT(SEQ ID NO：77)组成的VEGF结合肽；

由GRKIPIQ(SEQ ID NO：78)组成的补体蛋白c2结合肽；

由ARSNLDE(SEQ ID NO：79)组成的补体蛋白c3结合肽；

由QRALPIL(SEQ ID NO：80)组成的补体蛋白c4结合肽；

由GRLHMKT(SEQ ID NO：81)组成的补体蛋白c5结合肽；

由KRKIVLD(SEQ ID NO：82)组成的补体因子B结合肽；

由AAMFGPA(SEQ ID NO：83)组成的膜金属蛋白酶2结合肽；

由GALGLFG(SEQ ID NO：84)组成的膜金属蛋白酶12结合肽；

由EPLIHQR(SEQ ID NO：85)组成的棉花结合肽；以及

由SAFRGPT(SEQ ID NO：86)组成的棉花结合肽。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述融合蛋白被蛋白酶加工以释放蛋白酶抑制剂。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述融合蛋白包括葡糖淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶催化结构域、切割位点和蛋白酶抑制剂。