[发明专利]一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，公开了一种利用免疫化的超顺磁纳米粒子和免疫化的荧光量子点快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。

背景技术

食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点，《中华人民共和国食品安全法》于2009年2月28日在第十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议通过。食源性致病菌快速检测是采用微生物学、化学、生物化学、生物物理、免疫学的方法对食品及其加工、贮藏等环境中的致病菌进行分离、检测、鉴定和计数。

现在广泛使用的检测方法主要有三种：平皿培养分离计数法，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)与荧光PCR检验方法。

阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率高达50％以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受到人们的关注并被报告。

阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40％～80％。阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回。在美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。但是国内企业鲜有自查能力，原因是国内以前还没有专门的检测手段，而去买一套以前国内从未有过的检测设备也不是马上就可办到的。

传统的平皿培养分离鉴定法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方法对奶粉中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前最成熟，使用最广泛，作为基准的检验方法，但是存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。

PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。样品(经前处理增菌后)，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模版进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否污染食源性致病菌进行快速检验用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模版，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的假阳性和假阴性率。

为了对我国食品安全作出贡献，丰富致病菌检测方法，提高对食源性致病菌的检测速度，为可能出现的食品安全问题提供应对方法，需要对现有技术做出改进，研发了“磁性分离荧光标记定性定量检测乳粉中阪崎肠杆菌”方法。

发明内容

本发明旨在提供一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。

一种快速测筛选阪崎肠杆菌的方法，步骤包括：

(1)向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，15～35℃混合反应10～60min，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；

(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，15～35℃混合反应10～60min，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的致病微生物阪崎肠杆菌发生特异性结合；

(3)利用外加磁场吸引作用下收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；

所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外壳，表面偶联特异性抗体的磁性粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体；