[发明专利]一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法

说明书

本申请是申请日为2007年8月15日、申请号为200710143624.9的同名专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的公用接头设计方法。本发明又涉及一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法。本发明所述方法适用于针对任意长度的目标基因组区域的边扩增边连接工作，所得到的非特异连接的长链DNA可根据研究需要应用于多种DNA分析平台。本发明还涉及一种针对一个或多个目标基因组区域序列重测序工作、建立随机DNA文库的方法，所得随机DNA文库可用于通过包括Sanger测序技术、边合成边测序技术在内的测序方法对所述一个或多个目标基因组区域序列进行重测序。 

背景技术

自1983年Kary Mullis发明聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)以来，历经三十多年，PCR技术已成为生物科学领域不可或缺的、运用广泛的实验技术。为不同的实验目的，在标准PCR基础上又衍生出RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR，逆转录PCR)、Inverse PCR(反向PCR)，In Situ PCR(原位PCR)，Long PCR(长PCR)，Real Time PCR(实时PCR)，Single Cell PCR(单细胞PCR)，Hot Start PCR(热启动PCR)，Colony PCR(菌落PCR)，AFLPPCR(Amplified Fragment Length Polymorphism PCR，扩增片断长度 多态性PCR)等多项技术手段。可以说，自PCR技术问世以来，分子生物学及之后的基于大规模测序反应的基因组学均得到了飞速的发展。 

本发明应用碱基互补配对的基本原理，通过设计含“公用接头”的目标基因组区域的引物，在第一轮多核苷酸扩增反应后，第二轮多核苷酸扩增反应中，将目标基因组区域在扩增的基础上进行高效地连接，即“边扩增边连接”。连接工作按随机顺序进行，在本发明的上下文中这种随机顺序连接的方式称为“非特异连接”。经过边扩增边连接得到由目标基因组区域的DNA片段经“非特异连接”而成的长链DNA，此长链DNA可根据研究需要应用于多种DNA分析平台。 

通过本发明提出的“边扩增边连接”方法获得长链DNA，并经过DNA随机打断法打断，可建立用于通过包括Sanger测序技术、边合成边测序技术在内的测序方法对所述一个或多个目标基因组区域序列进行重测序工作的随机DNA文库。 

本发明可运用于一个目标基因组区域的边扩增边连接和随机DNA文库建立工作，也可用于两个及两个以上的多个目标基因组区域边扩增边连接和随机DNA文库建立工作。 

设计目的的不同，使本发明提出的“边扩增边连接”反应与同样使用接头设计的串联PCR方法具有本质的分别：串联PCR是根据具体研究的需要，进行特殊的接头设计，将本属基因组不同区域的DNA，甚至是不同物种基因组的DNA片断进行“特异性”连接，以获得研究所需要的“功能性DNA片段”。而本发明是为了得到特异扩增的、“非特异连接”的长链DNA。 

在本发明中，除在目标基因组区域的引物设计中在正向引物和反向引物的5’端和3’端分别加上本发明提出的一对反向互补的公用接头外，两轮多核苷酸扩增反应均无需特殊处理；非特异连接长链DNA的生成无需“连接酶”作用。 

本发明获得的长链DNA可突破在保真要求限制下的长PCR(LongPCR)方法目的片段长度的限制，而且可免去使用包含特殊酶物质的试剂盒及设计更严格引物的麻烦；与使用同连接区域特异配对之接头的 串联PCR(overlap PCR)方法相比，本发明只需设计一对公用接头，在第二轮多核苷酸扩增反应中利用公用接头将目标基因组区域原始DNA片段按随机顺序连接，又免去了设计多对可用于特异串联的互补引物的工序，对本行业的技术人员来说本发明所涉及的实验室工作是简单易行且费用很低的。 

发明内容

本发明基于以下认识：在目标基因组区域的每对引物设计中加入反向互补的同一对“公用接头”(Universal Adaptor)，对目标基因组区域的原始DNA片断进行特异性多核苷酸扩增和非酶法连接，形成由目标基因组区域DNA片段按随机顺序连接而成的长链DNA混合物。