[发明专利]一种快速检测细胞内火鸡疱疹病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对细胞内火鸡疱疹病毒的快速检测方法。 

背景技术

马立克氏病(Marek′s Disease，简称MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病，并以身体各组织发生单核细胞浸润进而最终形成肿瘤为特征。该病的病原为马立克氏病毒(Marek′s Disease Virus，简称MDV)，根据其致病性和血清型反应差别，可分为三类，即MDVI(强毒株及其致弱变异株)、MDV II(自然无致病性毒株)、MDV III(异源火鸡疱疹病毒，herpesvirus of turkey，下简称为HVT)。其中只有MDV I的强毒株及其变异超强株对鸡才有致病性。 

MDV III即火鸡疱疹病毒(HVT)，最早是由Kawamura和Witter从正常的火鸡体内分离得到的，普遍存在于家养火鸡中，对鸡没有致病性。美国Calnek等发现HVT用细胞裂解法可释放出脱离细胞的HVT完整病毒，从而成功地将HVTFc126疫苗株研制成了安全高效的冻干疫苗，在MDV的预防中发挥了极其重要的作用，此外，由于HVT具有可冻干保存、运输及不从羽毛囊散毒的特点，已被广泛用于防治MDV的疫苗上，成为世界范围内迄今最广泛使用的疫苗。用它制成的疫苗用于鸡的免疫，能产生较好的免疫保护性。用HVT作疫苗，不仅生产成本低，而且可以冻干的形式易于贮存和运输。 

目前疫苗用HVT多是由细胞培养生产，如鸡胚成纤维细胞(CEF)、JBJ等多种细胞都可以用于HVT的扩繁。在细胞培养病毒检测上，常规的方法有琼脂扩散法，噬斑计数法等方法，但是这些常规方法操作较繁琐，花费时间长，而且需要的病毒量较多。近年来，随着分子生物技术的发展，PCR被广泛用于病毒的检测，但是进行常规PCR检测需要先提取纯的DNA。 

发明内容

本发明提供一种快速检测细胞内火鸡疱疹病毒(HVT)的方法，具有快速、简便、灵敏、高特异性的特点。 

本发明提供一种快速检测细胞内火鸡疱疹病毒的方法，包括如下步骤： 

(1)样品处理：用胰酶消化待检测的细胞，离心后取沉淀，用缓冲液悬浮该沉淀，即得到样品DNA； 

(2)PCR扩增反应：以样品DNA作为模板，以HVT_F、HVT_R为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物； 

所述HVT_F的序列为5’-TTCGACATTCATGATGTTCTGGTG-3’， 

所述HVT_R的序列为5’-TGCGCTCGAAGAGTTACCGATC-3’； 

(3)电泳检测及结果分析：取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR电泳图谱中，对应于样品DNA的泳道在666bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了火鸡疱疹病毒。 

步骤(2)所述PCR扩增反应体系为：样品DNA、2.5μL的10×PCR缓冲液、2μL浓度为25mM的MgCl₂、0.5μL浓度为10mM的dNTPs、1.5μL浓度为10μmol/L的HVT_F、1.5μL浓度为10μmol/L的HVT_R、0.5μL浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶、14.5μL的ddH₂O；所述PCR扩增反应程序为94℃预变性10min；94℃变性45sec、54-57℃退火45sec、72℃延伸1min，35次循环；最后72℃延伸10min，获得PCR扩增产物。 

所述的退火温度最好为55℃； 

本发明根据HVT核苷酸序列设计引物HVT_F/HVT_R，实现了HVT的快速检测。该方法克服了常规的噬斑检测、琼脂双扩散、常规PCR等方法在该病毒检测上的缺陷，无需提取纯的DNA，操作简单，检测方便。 

附图说明

附图是检测火鸡疱疹病毒的电泳图，其中M-标准分子量，1-阴性对照，2-阳性对照，3-接种HVT-FC126的CEF。 

具体实施方式

实例一采用本发明方法检测HVT病毒 

以感染HVT-FC126的鸡胚成纤维细胞(CEF)为检测对象，以HVT-FC126冻干苗为阳性对照，以未感染的CEF细胞为阴性对照。