[发明专利]大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用

说明书

技术领域

本发明涉及大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及植物病毒胁迫应答的第5类病程相关蛋白。

背景技术

类甜蛋白最早是从非洲甜菊当中分离出来，后来在烟草、土豆、大麦、水稻上相继发现，研究表明它在离体条件下具有很强的抑菌抗菌活性(Ren et al.，2000)，将该蛋白导入植物体内可明显提高植物的抗病性，而且这类蛋白还对渗透胁迫产生反应(Ren etal.，2005)。许多类甜味蛋白基因已经被分离，并转化到了土豆，水稻，小麦和其它作物中。土豆中，转基因株系提高了对土豆晚疫病的抗性，表现为：转基因株系发病时间晚1-2d，病斑从接种点蔓延较慢，多数叶片上接种点病斑不扩散，叶片仍为绿色，嫩叶表现尤为突出(金红等，2001)。水稻中，转基因株系提高了对水稻纹枯病的抗性，表现为：接种Rhizoctonia solani Kühn两周后，T1和T2代转基因植株的受害面积均明显小于非转基因植株(Datta et al.，1999)。小麦中，转基因株系提高了对小麦白粉病的抗性，表现为：T1和T2代转基因植株推迟了病斑的发展，并且减轻了白粉病症状(XING et al.，2008)。其它作物如西红柿(Radhajeyalakshmi et al.，2005)、杂草(Fu et al.，2005)也有类似的报道。

本研究从大豆品种科丰1号中利用SMV诱导的双向电泳技术分离克隆了类甜味蛋白编码基因GmTLP1，并研究了其与SMV胁迫的关系，提出了利用GmTLP1基因进行植物提高综合抗病性的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开一个大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的综合抗病性，以进行植物品种改良。

技术方案

大豆TLP基因GmTLP1，其序列为：SEQ ID NO.2。其基因工程应用，包括：

1)大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的克隆

通过研究SMV诱导后的蛋白质差异表达图谱，分析鉴定出一个甜味蛋白，在大豆序列数据库中进行搜索，得到大豆TLP基因的全长序列，设计两端引物，引物序列见SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

以大豆(Glycine max)叶片的总RNA为模板，经反转录合成cDNA后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃复性50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃保温10分钟，随后12℃恒温，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的1021bp大小的大豆TLP基因的cDNA序列，见SEQ ID NO.1，其中编码区序列见SEQ ID NO.2，命名为GmTLP1，由669bp组成；

2)植物表达载体的构建

将GmTLP1基因与试剂盒中的pdonr vector载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，PCR引物见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，PCR程序同步骤1)，获得入门克隆(entry clone)；将得到的入门克隆与目的表达载体(destination vector)pMDC83进行重组反应，得到35S-GmTLP1-pMDC83植物过量表达载体，然后采用冻融法将35S-GmTLP1-pMDC83转入根癌农杆菌菌株EHA105中。

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体，通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，引物和具体的PCR过程与步骤1)相同，实时荧光定量PCR引物序列见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，Southern blot分析引物序列见SEQID NO.10和SEQ ID NO.11验证后进行植物的抗病性评价：

在直径为15cm的培养皿中，先用含终浓度为50μg/ml筛选抗生素Hgy的1/2MS生根培养基培养，待野生型未转基因烟草(C)及T₁代转基因株系萌发生长成小苗后(约两周)，将它们移栽至带有营养土的花盆中，用保鲜膜封口保湿，待小苗长到顶住保鲜膜后揭开保鲜膜，让其自由生长。待长到具有四出复叶时，在第二出复叶上接种烟草花叶病毒，每株接半片叶子，为避免磨擦接种时力度不一致造成的误差，接种时轻轻涂抹均匀即可。转基因植株出现病斑比野生型未转基因烟草C早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对C早20h以上。

有益效果