[发明专利]大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的抗病性基因工程应用

权利要求书

1.大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1，其序列为：SEQ ID NO.2。

2.权利要求所述大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的基因工程应用，包括；

1)大豆TLP蛋白编码基因GmTLP1的克隆

以大豆(Glycine max)品种科丰1号叶片的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性3秒，60℃复性50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温10分钟，随后12℃恒温，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的1021bp大小的大豆TLP基因的cDNA序列，见SEQ ID NO.1，其中编码区序列见SEQ ID NO.2，命名为GmTLP1，由669bp组成；

2)植物表达载体的构建

将GmTLP1基因序列与Invitrogen公司的Technology with Clonase^TM II试剂盒中的pdonr vector载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，具体的PCR过程与步骤1)相同，获得入门克隆；将得到的入门克隆与Invitrogen公司开发的目的表达载体pMDC83进行重组交换，得到35S-GmTLP1-pMDC83植物过量表达表达载体，pMDC83载体自身带有GFP报告基因，然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的含35S-GmTLP1-pMDC83载体的根癌农杆菌菌株EHA105通过叶盘转化法转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，引物和具体的PCR过程与步骤1)相同，实时荧光定量qPCR引物序列见SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，Southern blot分析引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11验证后进行植物的抗病性评价：

在直径为15cm的培养皿中，先用含终浓度为50μg/ml筛选抗生素Hgy的1/2MS生根培养基培养，待野生型未转基因烟草C及T₁代转基因株系萌发生长两周成小苗后，将它们移栽至带有营养土的花盆中，用保鲜膜封口保湿，待小苗长到顶住保鲜膜后揭开保鲜膜，让其自由生长，待长到具有四出复叶时，在第二出复叶上接种烟草花叶病毒，每株接半片叶子，出现病斑比野生型未转基因烟草C早14h，叶片枯斑损失面积达到叶片面积一半时相对C早20h以上的植株即为获得的过表达转GmTLP1基因植株。