[发明专利]一种免疫识别分子标记及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种免疫识别分子标记及其构建和应用。

背景技术

CpG-DNA是含有一个或多个未甲基化CpG的DNA序列，这种序列普遍存在于细菌等微生物病原的基因组中，但很少出现在脊椎动物基因组中，并且其在脊椎动物DNA中的上下游序列也与在细菌DNA中不同，因而CpG-DNA是一种微生物特有的分子标记，脊椎动物免疫系统凭此可以识别入侵病原并做出相应的免疫反应。这种免疫识别依赖于脊椎动物一种天然免疫识别分子，TLR9。TLR9是Toll样受体家族成员，其与CpG-DNA反应诱发一系列免疫反应，包括激活自然杀伤细胞、单核细胞以及巨噬细胞，促使淋巴细胞繁殖和抗原递呈等。这种免疫刺激特性使得CpG-DNA成为一种具有良好应用前景的免疫佐剂和抑菌分子。

CpG-DNA具有种属特异性，即不同种动物的有效CpG-DNA序列不同。对于养殖鱼类而言，目前已发现针对虹鳟、大西洋鲑鱼、鲤鱼等的CpG-DNA，但针对大菱鲆的有效CpG-DNA尚未见报道。由于大菱鲆是我国重要养殖经济鱼类之一，微生物病害问题是影响其产业发展的关键因素，因而开展大菱鲆特异性CpG-DNA研究对我国水产养殖业发展具有切实意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种免疫识别分子标记及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种免疫识别分子标记：免疫识别分子标记为大菱鲆特异性CpG-DNA序列，为序列表SEQ ID中的碱基序列所示。

构建：将质粒pCN3用BamHI酶切后与寡聚核苷酸CPG20用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的质粒；所述寡聚核苷酸CPG20为5’-GATCGATCGCGTGCGTGCGTCTAT-3’。

应用：所述序列表SEQ ID中的碱基序列能显著抑制致病性细菌的侵染或作为疫苗佐剂，增强疫苗的特异性抑制致病性细菌的侵染。所序列表SEQID中的碱基序列能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。所述具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液至浓度为20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的碱基序列的质粒的PBS溶液以100-120ul的剂量腹腔注射大菱鲆能显著抑制迟缓爱德华氏菌或嗜水气单胞菌侵染。

本发明具有如下优点：

1.能够非特异性抑制病原侵染。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA能够使鱼类抵御多种常见细菌病原的侵染。

2.具有疫苗佐剂效应。本发明的大菱鲆特异性CpG-DNA可以作为疫苗佐剂使用，能够增强疫苗的特异性免疫效应。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技术服务有限公司”合成。

实施例1

大菱鲆特异性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。序列表SEQ ID No.1为：

GATCGCGTGCGTGCGTCTAT

(a)序列特征：

●长度：20

●类型：核苷酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工设计

实施例2

含有大菱鲆特异性CpG-DNA序列的质粒pC205的构建：