[发明专利]基因编码的红色荧光蛋白的分子设计方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中荧光蛋白质领域，具体涉及基因编码的可逆光致变色的红色荧光蛋白和非可逆光致变色的红色荧光蛋白的分子设计方法。

技术背景

绿色荧光蛋白(GFP)是由基因编码的能在紫外光下发出绿色荧光的蛋白。通过对其分子结构的改造，能改进该荧光蛋白发出荧光的强度和颜色。因此，GFP作为报告基因被广泛应用于蛋白质标记、有机体的可视化等生物学领域。但是，GFP主要是在紫外光照射下发绿光，这会对生物体造成突变或伤害，不利于许多领域的应用。

藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)是天然蓝藻中的主要藻胆色素，由血红素在血红素氧化酶(HO1)与血红素还原酶(PcyA)催化下转化而生成，HO1与PcyA分别由hol与pcyA基因编码。PCB以硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸巯基共价结合并形成特定的构象，使得PCB色素蛋白能够吸收较大范围内的可见光，并发出相应的荧光。存在两种可高效共价偶联PCB的脱辅基蛋白，一种是蓝藻光敏色素中结合PCB的色素结构域GAF(基因片段)，另一种是核膜连接蛋白结合PCB的色素结构域ApcE(基因片段)。现有技术还没有公开通过对这两类能结合PCB的脱辅基蛋白基因片段进行分子设计后，与合成PCB的基因hol、pcyA融合，以产生新的分子设计的融合功能基因，该融合功能基因能编码可逆光致变色或非可逆光致变色的红色荧光蛋白。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对上述现有技术提出一种新的通过分子设计的方法，设计基因片段，编码出可逆光致变色或非可逆光致变色的红色荧光蛋白。

本发明为解决上述提出的问题所采用的解决方案为：基因编码的红色荧光蛋白的分子设计方法，其特征在于包括有以下步骤：

1)通过分子设计方法将血红素氧化酶基因hol的终止子突变为非终止子密码子，并在该基因之后设计编码5～15个氨基酸的DNA片段，将其与血红素还原酶基因pcyA进行融合连接，得到相应的融合基因hol:pcyA，通过该融合基因能够编码合成藻蓝胆素PCB；

2)将结合藻蓝胆素PCB的脱辅基蛋白色素结构域的基因片段，通过分子设计编码5～15个氨基酸的DNA片段，与步骤1)所得融合基因hol:pcyA再次融合，得到完整的融合功能基因，其能够编码可逆光致变色或非可逆光致变色的红色荧光蛋白；

3)将步骤2)得到的融合功能基因，转入外源生物细胞，在外源生物体正常表达时，得到具有可逆光致变色或非可逆光致变色的红色荧光蛋白。

按上述方案，所述的结合藻蓝胆素PCB的脱辅基蛋白色素结构域的基因片段为蓝藻光敏色素的色素结构域gaf或核膜连接蛋白的色素结构域apcE。

本发明描述了一种基因编码的红色荧光蛋白的分子设计方法，该方法首先将合成藻蓝胆素PCB的基因进行融合，再与结合藻蓝胆素PCB的脱辅基蛋白色素结构域的基因片段进行融合，可得到基因编码的红色荧光蛋白，在绿光或橙光照射下，发出红色荧光。如果结合藻蓝胆素PCB的脱辅基蛋白色素结构域的基因片段为蓝藻光敏色素的色素结构域gaf，则按照本发明介绍的方法可产生基因编码的可逆光致变色的红色荧光蛋白。如果结合藻蓝胆素PCB的脱辅基蛋白色素结构域的基因片段为核膜连接蛋白的色素结构域apcE，则按照本发明介绍的方法可产生基因编码的非可逆光致变色的发持续强烈红色荧光的蛋白。这些红色荧光蛋白在生物领域能广泛应用。

对于本发明所得到的具有可逆光致变色的红色荧光蛋白，当用650nm光辐射时，表现为536nm吸收增强，无荧光；当用500nm光辐射时，表现为648nm吸收增强，具有很强的红色荧光；即可逆光致变色范围648536nm。可以应用光谱检测制备的可逆光致变色的红色荧光蛋白(见图1)。该方法更适合应用于荧光探针、生物定位标记、光疗等功能领域中。

本发明的有益效果在于：通过本发明的分子设计方法所产生的基因编码的可逆光致变色的红色荧光蛋白，具有许多GFP所不具备的优点。首先，此红色荧光蛋白的荧光具有可逆光致变色的特性：应用该设计得到的具有可逆光致变色的荧光蛋白，在红光照射下，红色荧光消失，在绿光或橙光照射下，发出强烈的红色荧光。而类似设计的非可逆光致变色的红色荧光蛋白，则可以在绿光或橙光照射下持续发出强烈红色荧光。其次，这些红色荧光蛋白与GFP一样都是基因可编码的，可按照应用的需要，编码出符合要求的红色荧光蛋白，而且此红色荧光蛋白在应用时照射光源是红光、橙光或绿光，这类可见光对生物体伤害很小，故可以得到广泛应用。