[发明专利]一种小轴海绵活性产物储存细胞的标记方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，涉及海洋动物细胞的鉴定以及活性天然产物的代谢研究，具体地说是小轴海绵(Anixella sp.)中活性产物储存细胞(所指的储存细胞，其学名为“小球细胞”，英文为“Spherulous Cell”简称Sp细胞)的一种化学染色标记方法；本发明可简便准确地鉴别该类细胞，并为细胞培养和活性产物代谢提供分化和调控指标。

背景技术

海绵是海洋天然药源活性产物的重要来源，在海绵各种类型的细胞中，Sp细胞(Sp细胞)是活性产物的重要贮存场所。我国南海小轴海绵(Axinellasp.)中发现的两种具有治疗骨关节炎和老年痴呆症活性的生物碱，debromohymenialdisine(DBH)和hymenialdisine(HD)，也存在于该海绵的Sp细胞中。鉴于Sp细胞具有储藏次生代谢产物的特性，在目前的海绵细胞培养体系——细胞团培养的过程中，定向调控向Sp细胞分化，是具有应用前景的活性化合物生产方式。而对Sp细胞的分化跟踪和定性定量研究，需要找到一种其独有而稳定的标记方法。

目前对海绵细胞种类的鉴定，主要以形态观察为主。电镜观察比较清晰准确，但制样过程较繁琐；光镜观察虽简便但有一定局限性。对于小轴海绵而言，虽然Sp细胞在光镜下有显著的深棕色特征，但细胞于玻片上干燥后再浸润，便会丧失其颜色特性而变透明(由于溶胀导致内部小颗粒泄露所致)，不利于后续的观察鉴定。另外在小轴海绵中，除深棕色的Sp细胞外，还有部分内含颗粒的灰色细胞，在光镜观察时容易与Sp细胞混淆(图1-a)。细胞化学染色方法能够原位显示细胞的内含物质，具有操作简便和显色稳定的特点，可弥补电镜和光镜鉴定方法的不足。

以往的海绵细胞化学染色研究多集中于对常规细胞内含物(如DNA、RNA、糖原、脂肪等)的检测，此外也有关于海绵细胞的酸性磷酸酶和脂酶的活性报道。然而相关资料表明，迄今为止尚未能对海绵中的某类细胞建立特异性的染色标记。使用细胞化学染色方法表征小轴海绵种活性产物储藏细胞(Sp细胞)，具有重要的理论研究和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小轴海绵中活性产物储存细胞(Sp细胞)的简便可靠的鉴别方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

小轴海绵活性产物储存细胞(Sp细胞)的标记方法，使用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)染色液对固定后的海绵细胞染色，光学显微镜下观察，颗粒状着染的细胞为小轴海绵活性产物的储存细胞(Sp细胞)。

具体操作步骤为：

取小轴海绵细胞，使用含2-4％甲醛或2-3％戊二醛的无钙镁海水(CMFASW)(CMFASW中可含10-30mMEDTA)固定0.5-1.5小时，离心收集细胞，加入CMFASW调整细胞悬液密度约为10⁷个/ml，涂于载玻片，细胞涂片干燥后用蒸馏水浸泡除去盐分，向玻片上的细胞区域滴加3，3′-二氨基联苯胺(DAB)染色液，室温染色5-8分钟，洗掉染色液，光学显微镜放大400倍以上观察，细胞内含有深棕色着染颗粒(直径1-3μm)的，为小轴海绵活性产物的储存细胞(Sp细胞)。

所述的海绵细胞可以是海绵组织离散的细胞，也可以是细胞团培养不同阶段的细胞；无钙镁海水，可以是常规配方的不含钙镁离子的人工海水，其中NaCl含量30-35g/L；3，3′-二氨基联苯胺(DAB)染色液的组成为3，3′-二氨基联苯胺(DAB)2.5-10g/L，过氧化氢(H₂O₂)0.1-1％，三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)3-10g/L，pH7.2-7.4。

本发明的优点如下：

1.本方法简便易行，与电子显微镜观察鉴定相比，避免了使用复杂的制样流程和昂贵的试剂仪器，节约了操作成本和时间。

2.光学显微镜下观察，小轴海绵中除了深棕色的Sp细胞(图1-a箭头所指)以外，还有部分深灰色细胞(图1-a三角所指)，两者易于混淆；本方法使用化学染色法显示小球细胞内部独有的过氧化物酶体，与单纯的外观观察相比，结果更准确可靠。

3.过氧化物酶是广泛存在于动植物中的一类酶，但很多细胞的酶活水平不足以在化学染色中显色(如图5所示的繁茂膜海绵，就无明显着染细胞)，本发明充分利用了小轴海绵Sp细胞与其它类别细胞在酶活性质上的巨大差异，以DAB染色方法，清晰地显示了活性产物储存细胞，便于在细胞分化和代谢调控研究中的大规模计数和统计。

4.细胞经染色后可长期保存和观察。

附图说明