[发明专利]促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及到一种能够促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗。

背景技术

胶体金(Colloidal gold，CG)是指纳米金颗粒的一种存在状态，即金粒子粒径大小约为1～100nm之间，存在于溶液中。胶体金是氯金酸的水溶液，属悬胶液，为带负电的胶体。胶金粒和其它胶一样也具有双层电结构，中心为许多金分子构成的胶金核，其外为AuO₂^-及部分反离子形成的吸附层，胶金核同吸附层一起组成胶金粒。胶体金如其它纳米颗粒一样属单晶和多晶微粒，具有小尺寸效应、良好的表面和界面效应、靶向作用及缓释作用等。目前，胶体金主要应用于免疫金标记技术及相关传感器技术，还没有应用于免疫佐剂的研究报道。

目前人和动物用的常规免疫佐剂主要是乳化的油-水佐剂、金属盐类佐剂(如铝佐剂)、完全福氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant，CFA)和不完全福氏佐剂(Incomplete Freund’s adjuvant，IFA)等。但它们对抗原性较弱的多肽，特别是重组抗原效果不佳，或存在严重的副作用，注射后在注射部位常引起无菌化脓，有时还会形成肉芽肿，且有长期的油滞留于组织，易引起过敏反应等问题。

研究表明，与周围神经损伤后的成功再生相比，中枢神经(CNS)再生失败的主要原因是由于损伤微环境中多种再生抑制分子的存在。目前已发现这种轴突再生抑制分子主要有三种：Nogo-A、MAG(Myelin-associated glycoprotein)和OMgp(Oligodendrocyte-myelin glycoprotein)，尽管三者蛋白结构明显不同，但却均能通过一个共同受体Nogo-66受体(Nogo-66receptor，NgR)及其下游可能的信号通路，参与神经再生的抑制作用。尽管有研究表明采用脊髓组织匀浆或髓鞘提取物免疫动物治疗脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)可通过产生抗体封闭其抑制作用，促进损伤脊髓的恢复，但脊髓组织匀浆或髓鞘提取物成分特别复杂，诱发自身免疫病的风险极高。鉴于NgR特殊的靶分子效应，选择NgR为免疫原既可促进脊髓损伤后轴突再生，对神经元起到保护作用，又可最大程度地降低诱发自身免疫病的风险性，从而开辟了克服CNS再生失败的新途径，为进一步揭示神经再生机制及相关药物开发提供了新的契机。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进中枢神经再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，以提高其免疫效果，并减小其毒副作用。

本发明所述促进中枢神经再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是由下述方法制成的组合物：

将纯化的hNgR-Fc融合蛋白溶解于缓冲液中，所得溶液与等体积的胶体金混合得混合液，在混合液中加入稳定剂。

hNgR-Fc融合蛋白在组合物中的浓度为30～60μg/ml。

所述缓冲液的pH值为4～9。

所述缓冲液为浓度为0.005～0.015M的柠檬酸钠缓冲液。

所述胶体金的粒径为10～50nm。

所述稳定剂为聚乙二醇20000，其在组合物中的浓度为200～500μg/ml。

本发明以hNgR-Fc(Fragment cristallizable)融合蛋白作为免疫原，并采用胶体金作为蛋白疫苗的免疫佐剂。受体-Fc融合蛋白已经被证实是除了抗体药物以外，清除体内多余配体分子的又一有效手段。受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能，而Fc部分可有多种作用，如可使用通用的标记二抗进行检测，可通过与protein A的结合而使用亲和层析方便地纯化，大大延长药物在体内的半衰期，可提供额外的生物学效应，如补体激活、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)等免疫调节活性。与抗体药物相比，受体-Fc融合蛋白可不必进行繁琐的抗体筛选和人源化过程，并具有亲和力高、免疫源性低等优势。

胶体金颗粒标记蛋白质(抗体、抗原)是通过异性电荷吸引产生的结合，这种结合不影响蛋白质生物活性和免疫活性，这为胶体金作为免疫佐剂提供了理论依据。纳米颗粒均匀性好，以其作为佐剂，可有效避免载体效应，延缓抗原的释放，持久增强机体体液免疫和刺激淋巴细胞增殖，更重要的是它包裹的抗原颗粒是巨噬细胞(Mφ)和树突状细胞(DC)的首选吞噬目标，为实现机体的有效免疫反应迈出重要一步。纳米颗粒还可形成水凝胶，特别适合做蛋白质/多肽类药物载体，且不需要交联别的试剂或佐剂。