[发明专利]荧光定量PCR检测马秋波病毒的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种利用荧光定量PCR检测马秋波病毒的方法。

背景技术

马秋波病毒(machupo virus，MACV)属于沙粒病毒属(Arenavirus)， 有包膜，毒粒呈多型性，大小为80～150nm。1963年首次在玻利维亚委内 瑞拉暮鼠(Calomys callosus)中分离到的。病毒基因组为单负链RNA双 环，分节段，细胞质内复制。几乎所有的沙粒病毒都能引起啮齿类动物 持续性感染。马秋波病毒被视为沙粒病毒属中新世界病毒的代表之一。 它与胡宁病毒(Junin)、瓜纳里托病毒(Guanarito)是引起人出血热重要病 毒，主要症状表现为发烧、乏力、肌肉酸痛、厌食等，3-4天后会伴随头 痛头晕、恶心和严重衰竭，潜伏期在1-2周。其高致病性和致死率不低于 30％。

虽然，我国还未发现感染马秋波病毒的病例存在，但是随着全球经 济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国 际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传 播。传染病在国际间的广泛传播与流行，已成为各国政府密切关注的政 治问题。《国际卫生条例》、《中华人民共和国卫生检疫法》、都对传 染病风险预警与快速决策做出了相应的规定。我国在“十一五”期间将传 染病防控提升到战略的角度，予以高度重视。

目前，针对外来疫病的实验室快速检测技术主要采用的是免疫学检 测及核酸检测技术，尤其是以PCR技术为代表的核酸检测技术，能够非 常灵敏的检测到各种疫病病原体。但是由于PCR扩增技术经常带来特异 性问题，各国科学家和技术人员都在PCR技术基础上，结合其它新技术， 努力改善PCR技术的特异性和敏感度。近年来，基于PCR技术及ABI Taqman探针杂交技术发展起来的实时荧光PCR技术极大地改善了传统 PCR技术的特异性和敏感性以及抗污染的能力，已经越来越广泛的应用 到各种疫病的检验检疫中。随着探针技术的进一步发展完善，一种新型 的Hydro Easy Probes的出现，能够有效的改进Taqman探针本底信号高 的缺点，并且进一步提高检测的灵敏度。本发明拟采用新型Hydro Easy Probes设计技术，开展马秋波病毒的荧光PCR检测试剂研究，使之成为 应对外来疫病传入我国的有力武器，保障人民群众的生命安全和国家的 卫生安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马秋波病毒的荧光定量PCR检测方法。 该方法利用实时荧光定量PCR检测技术，设计了一对引物和探针对病毒 样本进行实时定量检测。检测特异性好，灵敏度高。

本发明检测方法首先包括获得检测马秋波病毒的引物和探针的步 骤，该步骤具体为：(1)筛选马秋波病毒S片段全长序列，进行同源性 比对，在其保守区设计引物；(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设 计特异性探针，并提交至GENEBANK中检测探针的特异性；(3)对待 检测物进行实时定量分析。

在本发明上述方法中，所筛选的马秋波病毒可以是NCBI公布的所有 马秋波病毒S片段全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR 软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1。图中阴影部分为S基因序 列高保守区。

在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游 引物，根据引物设计原理，在保守区之间设计上游和下游引物，其中在 上游引物的第16位存在简并性，下游引物的第14位存在简并性，设计 位于扩增区域内的特异的探针，其中在探针的第1位和第30位分别存在 简并性。引物和探针在合成时，探针5′端连接FAM荧光基团，3′端连 接BHQ非荧光基团。引物的特异性增强。引物和探针序列见表1。

表1

表2为利用软件分析设计的引物和探针的参数。

表2

本发明检测方法其次包括检测马秋波病毒的步骤，该步骤具体为：

(1)核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒。

(2)RT-PCR扩增

选用的扩增试剂盒为ABI公司AgPath-ID^TM One-step RT-PCR Kit。

反应体系组分及其体积见表3。

表3

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。