[发明专利]鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因植物检测领域，特别是涉及鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体 的PCR方法

背景技术

我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年种植面积位于全球第六位。我国商业化 种植的转基因作物主要为转基因抗虫棉花何抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中，转Bt 基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉花种 植总面积的近70％(James，Clive.2009.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops： 2009.ISAAA BriefNo.41.ISAAA：Ithaca，NY.)。我国种植的转基因棉花主要为抗虫转基因棉 花。此外我国还允许国外抗除草剂棉花LLCOTTON25、抗虫转基因棉花531等5个转基因棉花 进口用作加工原料(http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。

抗除草剂棉花LLCOTTON25是由拜耳作物科学公司研发的通过农杆菌介导的转bar基因 的抗除草剂棉花品种，2003年在美国被批准商业化应用，随后陆续在澳大利亚、巴西、加拿 大等国被批准应用(http://www.agbios.com/dbase.php？action＝Submit&evidcode＝LLCotton25)。 我国于2006年批准抗除草剂棉花LLCOTTON25进口用于加工原料(农基安证字(2006)第360 号)。因此建立抗除草剂棉花LLCOTTON25的快速、特异性的检测方法对其监管和安全性评 价显得十分必要。

目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因 作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因 通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶 标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异 性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类 检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系 检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法 能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

经检索公开文献和专利发现，目前尚没有抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性 片段序列的报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，本发明提供了抗除草剂棉花LLCOTTON25的5‘端和3’端转化体 特异性序列以及鉴别抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利 用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出抗除草剂棉花LLCOTTON25，以及以抗除草剂棉花 LLCOTTON25为亲本的棉花品系。

鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系 中的正向引物是根据Seq ID No.1所示核苷酸序列1-1723bp位置设计，反向引物是根据Seq ID No.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置设计。

所述正向引物为LL25-5F：5‘-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3’，

所述反向引物为LL25-5R：5‘-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3’，扩增的片段为长度为411 bp。

鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法，其特征在于PCR 体系中的正向引物是根据Seq ID No.2所示核苷酸序列1-476bp位置设计，反向引物是根据Seq ID No.2所示核苷酸序列477-1010bp位置设计。

所述正向引物为LL25-3F：5‘-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3’，

所述反向引物为LL25-3R：5‘-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3’，扩增片段长度为430bp。

本发明通过Genome walking方法获得转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异 性序列，一条为外源重组载体5’端插入区域的特异性旁侧序列，另一条外源重组载体的3’端 插入区域的特异性旁侧序列，根据这两条旁侧序列任意一条设计引物对，能够专门用检测 LLCOTTON25及以其为亲本的棉花品种。