[发明专利]一种巴马香猪体细胞克隆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物繁殖、动物胚胎生物技术，具体是一种巴马香猪体细胞克隆的方法。

背景技术

至今并未发现有与本发明相同或相似的报导。

发明内容

本发明的目的是为了：

1.解决人类异种器官移植所进行转基因猪研究必需的关键技术问题，为基因打靶猪和异种器官移植等研究奠定基本而又必要的研究手段。

2.为具有重要经济价值的优良地方品种巴马香猪的保种开辟了一条新的途径，也可大量繁育其它具有优良性状的种猪，解决优良种猪引种、保种和品种改良等问题，大大加快优良种猪引种、保种和品种改良的速度。

3.对探讨猪早期胚胎发育的全能性，揭示猪胚胎、组织、个体发育中基因组印迹现象的本质，对研究发育过程中同种动物或异种动物核质互作关系，特别是对解决核遗传物质(核DNA)与细胞质遗传物质(线粒体DNA)的调控和相容性等发育核心问题均具有重要价值。

提供一种具有重要经济价值的优良地方品种巴马香猪体细胞克隆的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种巴马香猪体细胞克隆的方法，是按以下步骤进行操作：

1.相关试剂的配制

1)磷酸缓冲液DPBS的配制：

磷酸缓冲液DPBS的配制称取：DPBS粉剂9.5克/L，青霉素66μg/L，和链霉素100μg/L，超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存。

2)体细胞培养液DMEM的配制：

体细胞培养液DMEM的成分为：DMEM粉剂9.5g/L，44mM NaHCO3，1mM丙酮酸钠，66mg/L青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，10％-15％的FCS和1％的非必需氨基酸。

DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO₃，丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调pH至7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于4℃备用。使用前添加FCS和非必需氨基酸。使用前放在培养箱内预热平衡。

3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制：

细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为：2.5mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mlEDTA-Na。

取胰蛋白酶和EDTA-Na溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于-20℃备用。

4)体细胞冷冻液的配制：

10-15％FCS的DMEM培养液中加入10％DMSO。

5)洗卵液的配制：

洗卵液为改良TL-Hepes-PVA液，调pH至7.2-7.4后，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤分装，放于4℃保存，1-4周内用完，使用前放在35-39℃恒温箱中预热。

6)体外成熟液的配制：

体外成熟液为改良的TCM-199，其成分为：3.05mM D-glucose，0.91mMSodium pyruvate，26.19mM NaHCO₃，0.09mM EDTA·Na₄·2H₂O，75μg/mlPenicillin G，50μg/ml Streptomycin，0.57mM半胱氨酸、10ng/ml EGF，0.5μg/ml FSH，0.5μg/ml LH和10％卵泡液；用滤膜孔径为0.22μm滤器过滤，分装，4℃保存备用。使用前，在成熟液中添加半胱氨酸、EGF，FSH，LH和卵泡液。

7)胚胎培养液的配制：

采用NCSU-23或者PZM-3培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，1-4周内用完。

8)核移植操作液的配制：

在洗卵液中添加5-15％FCS，使用前将其放在35-39℃恒温箱中预热。

9)融合激活液：

称取0.25M甘露醇，0.1mM CaCl₂·2H₂O，0.1mM MgSO4·7H₂O，0.5mMHepes，用超纯水定容，调整pH值7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，使用前在35-39℃恒温箱中预热。

10)细胞松弛素B的配制：

用DMSO溶解细胞松弛素B(CB)，最终工作浓度为5-7.5ug/ml，分装到Eppendorf管中，-20至-80℃冻存，工作浓度为5-7.5μg/ml。

11)猪卵泡液的配制：