[发明专利]一种巴马香猪体细胞克隆的方法

权利要求书

1.一种巴马香猪体细胞克隆的方法，其特征在于，按以下步骤进行操作：

1)相关试剂的配制：

(1)磷酸缓冲液DPBS的配制

磷酸缓冲液DPBS的配制称取：DPBS粉剂9.5克/L，青霉素66μg/L，和链霉素100μg/L，超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存；

(2)体细胞培养液DMEM的配制：

体细胞培养液DMEM的成分为：DMEM粉剂9.5g/L，44mM NaHCO3，1mM丙酮酸钠，66mg/L青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，10％-15％的FCS和1％的非必需氨基酸；

DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO₃，丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调pH至7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于4℃备用。使用前添加FCS和非必需氨基酸。使用前放在培养箱内预热平衡；

(3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制：

细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为：2.5mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mlEDTA-Na；

取胰蛋白酶和EDTA-Na溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后储于-20℃备用；

(4)体细胞冷冻液的配制：

10-15％FCS的DMEM培养液中加入10％DMSO；

(5)洗卵液的配制：

洗卵液为改良TL-Hepes-PVA液，调pH至7.2-7.4后，用滤膜孔径为0.22μm滤器过滤分装，放于4℃保存，1-4周内用完，使用前放在35-39℃恒温箱中预热；

(6)体外成熟液的配制：

体外成熟液为改良的TCM199，其成分为：3.05mM D-glucose，0.91mMSodium pyruvate，26.19mM NaHCO₃，0.09mM EDTA·Na₄·2H₂O，75μg/mlPenicillin G，50μg/ml Streptomycin，0.57mM半胱氨酸、10ng/ml EGF，0.5μg/ml FSH，0.5μg/ml LH和10％卵泡液；用滤孔为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存备用。使用前，在成熟液中添加半胱氨酸、EGF，FSH，LH和卵泡液；

(7)胚胎培养液的配制：

采用NCSU-23或者PZM-3培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，使用前添加BSA，1-4周内用完；

(8)核移植操作液的配制：

在洗卵液中添加5-15％FCS，使用前将其放在35-39℃恒温箱中预热；

(9)融合激活液：

称取0.25M甘露醇，0.1mM CaCl₂·2H₂O，0.1mM MgSO4·7H₂O，0.5mMHepes，用超纯水定容，调整pH值7.2-7.4，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，4℃保存，使用前在30-39℃恒温箱中预热；

(10)细胞松弛素B的配制：

用DMSO溶解细胞松弛素B(CB)，最终工作浓度为5-7.5μg/ml，分装到Eppendorf管中，-20至-80℃冻存，工作浓度为5-7.5μg/ml；

(11)猪卵泡液的配制：

抽取猪卵巢上直径3-8mm的卵泡，将抽取液放入离心管中离心，收集上清液，用滤膜孔径为0.22μm的滤器过滤，分装，-20至-80℃保存备用；

(12)FSH和LH储存液的配制：

取TCM-199成熟液储存液放入小瓶内，先称量少量BSA或者血清溶解后，再加入FSH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20至-80℃保存备用；用同样方法配制LH，使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0.5-1.0μg/ml；

(13)Hyaluronidase的配制：

透明质酸酶储存液的配制：称取透明质酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，过滤，分装到Eppendorf管中，-20至-80℃保存。使用时稀释；

(14)EGF储液的配制：

称量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液，分装，-20至-80℃保存备用；

2)巴马香猪体细胞的培养：

将巴马香猪用75％酒精喷过后，迅速用磷酸缓冲液或者生理盐水冲洗，然后用灭菌过的手术刀或者剪刀，获取其组织，将其放入含青、链霉素的磷酸缓冲液或者生理盐水中清洗，然后用75％酒精快速清洗后，再用含青、链霉素的磷酸缓冲液或者生理盐水中彻底清洗；

在超净工作台内，把组织块移到灭菌过的小瓶中，用眼科剪将其剪碎，加入磷酸缓冲液或者生理盐水，将剪碎的组织块移到灭菌离心管中离心，洗涤，弃掉上清，向沉淀中加入少许DMEM全基培养液，把剪碎的组织块移到培养皿中摊均匀，转入5％CO₂培养箱(37℃和最大饱和湿度)培养，第二天加入DMEM培养液；以后每2-3天换液一次，待细胞长到70-80％汇合时，轻轻拨掉组织块，然后将其和培养液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然后加入DMEM终止消化，并轻轻吹打；然后将液体移到灭菌的离心管中，离心，弃掉上清，再向离心管中加入新鲜的DMEM培养液，重悬细胞，调整浓度后，接种到培养皿中，继续培养，每2-3天换液一次。70-90％汇合时，将细胞传代或冷冻；

3)巴马香猪体细胞的冷冻：

巴马香猪体细胞体外培养长到70-90％汇合时，用磷酸缓冲液清洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分细胞变圆部分细胞已脱壁时迅速加入DMEM终止消化，吹打至细胞完全脱壁，把细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入细胞冻存液，吹打均匀后分装到细胞冻存管内，于4℃冰箱中置一段时间，再放入-20至-80℃冰箱过夜，过夜后直接将冻存管放入-80℃液氮罐中；

4)冷冻体细胞的解冻：

从-80℃液氮中取出冻存管，快速投入30-37℃温水中，不断摇动冻存管，待冰块全部融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入预热的DMEM培养液，离心清洗，然后用预热的DMEM调整细胞浓度后接种到培养皿培养；

5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养：

从屠宰场收集猪卵巢，放入含有双抗的30-37℃生理盐水或者磷酸缓冲液中，送回实验室，用含双抗的生理盐水或者磷酸缓冲液冲洗，带入无菌操作室，用装有针头的注射器抽取卵巢表面直径为2～6mm的卵泡，将抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，静置一段时间，用洗卵液稀释后放在实体显微镜下，用玻璃吸管挑选带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗涤，用预平衡的成熟液洗涤，最后放入含FSH和LH的成熟液滴中，培养22小时，然后移入不含激素的新鲜成熟液滴中继续培养22-24小时，培养条件为：5％CO₂、最大饱和湿度、38.5-39℃；

6)核移植：

(1)卵母细胞的准备：

将体外培养40-44h的猪卵母细胞在透明质酸酶中作用，轻轻吹打除去周围卵丘细胞，用玻璃拨卵针在实体显微镜下轻轻转动卵母细胞，挑选出胞质均匀且有极体排放的卵母细胞为核移植备用；

(2)巴马香猪体细胞的准备：

把3-10代生长状态良好的细胞，去除培养液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90％的细胞已脱壁时，加入预热的DMEM终止消化，轻轻吹打，然后将细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入显微操作液，重悬细胞离心洗涤，弃上清后加入显微操作液，重悬细胞，然后再向混合液中加入CB，使终浓度为5-7.5μg/ml；

(3)操作滴的准备：

用上述调整好的细胞悬液，做成长条型液滴，上面覆盖石蜡油，将挑选出的卵母细胞放在操作液滴中，在显微操作仪下去核操作。吸取中等大小圆形、表面光滑，细胞膜折光度较好的供体细胞通过透明带切口注射到透明带下方，并轻点透明带使供体与卵母细胞膜接触良好；

(4)重构卵的融合/激活和培养：

将重构卵放在含有CB的胚胎培养液滴中，恢复一段时间，然后把恢复好的重构卵移到融合液中洗涤，把每批重构卵放在铺满融合液的融合槽两电极间，用玻璃针轻轻转动重构卵，使注入的体细胞与两电极平行，随后按下融合仪开关，进行融合，直至重构卵激活完毕，融合后的重构卵用胚胎培养液洗涤，放入平衡好的含CB的胚胎培养液滴中培养一段时间，挑选融合好的重构卵，用胚胎培养液洗涤，然后移到胚胎培养液滴中培养，培养条件为：38.5-39℃，5％CO₂，最大饱和湿度；

7)胚胎移植：

选用后备或经产的猪作为受体母猪，停喂食料，将胚胎移植当天和前一天构建的核移植胚胎和孤雌激活胚胎置入平衡到37-39℃的便携式恒温箱中，受体母猪进行麻醉后绑定，清洗手术部位并消毒，准备手术，将手放入腹腔内找出输卵管和卵巢，适当拉出，采用刺入式胚胎移植法进行胚胎移植，从便携式恒温箱中取出待移植胚胎，刺入输卵管后将胚胎缓缓地输入其中，输毕，撤出，并进行缝合，术后连续两天注射青、链霉素防止炎症发生，单独隔离受体母猪，注意观察愈后情况。