[发明专利]一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法和用于实施该方法的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及细胞DNA损伤检测技术，特别涉及一种蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备方法和用于实施该方法的试剂盒。

背景技术

单细胞凝胶电泳图像分析(Si ngl e Cell Gel El ect r ophor esi s，SCGE)技术，又称彗星检测法(Comet Assay)，是一种80年代末发展起来的研究和定量检测单个细胞DNA损伤的简单、灵敏、快速的新技术。在有关因子诱发下，细胞的DNA若受到损伤，会引起其高级结构变化，致使其超螺旋结构松散。当细胞发生原位裂解、DNA解旋等现象时，损伤的DNA片段在电泳时会从核中移出，向阳极迁移并呈现尾形分布，而细胞无损部分仍保持球形。经荧光染料染色后，可用荧光显微镜观察到这些细胞形成彗星状图样；而且一定条件下，DNA的迁移距离(表现为彗星尾长度)和DNA的迁移含量(表现为荧光强度)的分布与DNA受损伤程度相关，此即为单细胞凝胶电泳图像分析技术研究和定量分析的基础。

目前世界上通用的方法是采用Si ngh NP等建立和改进的碱性单细胞凝胶电泳图像分析(Al kal i ne Si ngl e Cell Gel El ect r ophor esi s，ASCGE)技术，一方面在高pH值碱性条件下，细胞DNA中碱易变性部位和断链更易出现，还可促使RNA降解，所以检测的灵敏度较高；另一方面，利用碱性条件溶解细胞和电泳，提高了检测的敏感性；此外，能同时检测DNA双链断裂和单链断裂，并通过加入特定的DNA内切酶来确定DNA链上的易感位点，从而使该技术的应用范围极广泛。与其他DNA链断裂检测技术，如原位杂交技术、高效毛细管电泳技术、高效液相色谱、气相色谱-质谱法等相比较，单细胞凝胶电泳图像分析技术具有敏感、快速、简便、重复性好、低耗等特点。因而单细胞凝胶电泳图像分析迅速成为流行的DNA损害检测方法，广泛应用于遗传毒理学、职业与环境生物监测、辐射生物学、肿瘤学、老年学、环境生态学以及氧化应激和细胞凋亡有关的多种病理过程研究；并可进行药物对DNA损伤的抑制和修复检验、肿瘤放疗化疗疗效评估检验、辐射对细胞DNA的损伤检验、病毒对细胞的DNA损伤检验、疾病的定性定量诊断和疗效分析、以及公安法医毒物分析等。

植物蚕豆由于其根尖细胞的染色体大，数量少，DNA含量多，对诱变剂反应敏感，因此被常用于作为样品来进行单细胞凝胶电泳图像分析。蚕豆根尖细胞彗星实验样品制备基本步骤包括：(1)样品凝胶玻片的铺片；(2)细胞裂解；(3)解旋与电泳；(4)中和洗涤；(5)荧光染色。不同的样品制备方法最大区别在于铺片步骤。铺片步骤实质上是将单个的细胞和/或细胞核固定包埋在凝胶里。固定包埋的好坏决定是否有足够数量的完整的细胞核用于结果分析，决定荧光染色后图像背景是否干净便于显微分析，固定包埋过程时间的长短决定损伤DNA被恢复的程度，时间越短，恢复的程度越小，结果越客观。总之，铺片步骤的操作直接决定实验结果的质量，是整个蚕豆根尖细胞彗星试验技术的关键环节，是已往报道技术的主要差别所在。已往报道的蚕豆根尖细胞彗星试验技术在铺片步骤大体有以下几种做法：

(1)酶法：取3-5个蚕豆根尖，在缓冲液中切碎，加纤维酶和果胶酶分解约3小时，取细胞核上清液铺片。此方法最大优点在于可获得大量细胞核，最大缺点在于耗时，操作不便且微损伤DNA被恢复的可能性大，因而实际应用不多。

(2)机械法：取3-5个蚕豆根尖，在缓冲液中切碎，经分样筛或尼龙纱过滤，离心(有些技术不离心)，取细胞和/或细胞核铺片。此方法较酶法简便，但最大缺点在于获得的细胞核很少，如缓冲液不合适，甚至不能获得用于结果分析的足够数量的细胞核。此外，该方法获得的图像背景差(因组织碎片等杂质多)，不便显微分析。此方法因相对简便，是目前应用的主要技术。

分离数量适当的、完整的单个细胞和/或细胞核来铺片是决定蚕豆根尖细胞彗星试验成败的关键因素，不同技术的分离方法需要的器材(如离心机、过滤材料)不同，时间不同，效果也有很大差异。已报道的蚕豆根尖细胞彗星试验技术所用的细胞和/或细胞核分离方法均采用机械法或酶法，以机械法偏多，而且不同技术用机械法分离单个细胞和/或细胞核时采用的分离缓冲液差别很大(有：Sor ensenbuffer、PBS、Tris-HCl、MBS、Hbnda buf fer等)。多个研究报道表明缓冲液的选择对分离效果继而对实验成败影响很大，因而不同技术的实际效果有很大差异。此外，上述技术在铺片时有采用三层胶，也有采用二层胶的，胶的浓度也略有不同；铺片时用的玻璃片有磨砂的，也有普通的。