[发明专利]一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体

说明书

技术领域：

本发明涉及一种DNA，特别是一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体。

背景技术：

基因治疗技术是随着DNA重组技术的成熟而逐渐发展起来的，是当代医学和生物学的一个新的研究领域。基因治疗是通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷而发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。自从20世纪90年代初首次成功进行基因治疗的临床试验以来，迄今已完成了数千例基因治疗临床试验。作为一种分子药物治疗形式，基因治疗为许多遗传性和获得性疾病提供一种新的治疗方式。从早期单基因遗传病的治疗，目前已扩展到对人类健康威胁严重的多基因疾病，包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病，以及感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。

载体(vector)是将外源基因导入宿主细胞的运载工具。基因治疗载体系统包括病毒与非病毒两种。目前大多数临床基因治疗仍采用转染率较高的病毒载体，外源基因整合到宿主的染色体上，存在着潜在的致癌性、自身免疫原性和/或造成细胞病理改变等。和病毒载体相比，非病毒载体虽然有很多优点，但其转染效率低，持续表达时间短，大多为瞬时表达，如要稳定持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，载体的随机整合会引起插入突变或导致转基因的沉默。此外，目前所用的基因治疗表达载体都包含原核质粒的序列，如在大肠杆菌中起复制起始作用的DNA序列、在细菌中筛选阳性克隆的抗药性基因标志等，这些DNA序列便于插入真核基因后能在大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。但是这些原核质粒序列在真核宿主细胞并不具备任何功能，并且基因治疗导入宿主细胞后对患者存在潜在的危险，如由于抗药性抗性基因失控导致的随机分布、某些未知表达信号激活等。因此，构新型、高效、安全的基因治疗表达载体，是基因治疗中亟待解决的问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种安全性能好、效率高的人类和哺乳动物细胞游离表达载体。本发明的技术方案是，其特征在于：所述载体的多克隆位点下游和上游分别含有人源性的MAR和有治疗作用的外源基因DNA片段且只含有真核表达元件的表达载体。此载体可作为基因治疗的应用。本发明与现有技术比较具有安全性能好、效率高的显著优点。

附图说明：

图1是pEGFP-C1初始载体结构图，载体购自clontech公司，其上带有启动子CMV和EGFP基因。

图2使中间载体pEMW构建流程图，其中MCS位点含有BglII、XhoI、SacI、HindIII、EcoRI、PstI、SalI(AccI)、KpnI(Asp7181)、SacII、ApaI(Bsp1201)、XmaI、SmaI、BamHI。

图3是游离性表达载体pEVW的构建流程图，其中MCS位点含有BglII、XhoI、SacI、HindIII、EcoRI、PstI、SalI(AccI)。

图4是pEVWN载体的结构图，HindIII/SalI酶切pEVW及β-hNGF基因片段，连接，载体大小为6919bp。

具体实施方式：

pEGFP-C1载体为人类及哺乳动物细胞的表达载体，其上含有增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein gene，EGFP)基因，EGFP基因为报告基因，其主要作用是为了在宿主细胞中容易检测目的基因的表达。因此本发明中首先将EGFP基因删除，替换为一段新合成的含CMV启动子和多克隆位点(multiple cloning site，MCS)的DNA序列。此外，pEGFP-C1载体含有kan/Neo筛选标记及原核表达调控元件，这些筛选标记及原核表达调控元件在载体的克隆、筛选具有重要作用，但基因治疗导入宿主细胞后对患者存在潜在的危险因素。因此，本发明引入了一个新的ClaI酶切位点，使构建的pEVW载体具备2个相同的ClaI酶切位点。在载体构建、克隆完成后，利用ClaI酶切位点酶切pEVW载体，删除原核质粒元件，然后用T4DNA连接酶连接，纯化后用于人类的基因治疗。

结合以下实施例具体说明本发明所述载体pEVW的构建过程与应用。

本发明实施例中所使用的质粒载体pEGFP-C1(质粒图谱如图1所示)购自clontech公司，所使用的菌株E.coli DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司，所使用的试剂均为市售商品。

实施例1：中间载体pEMW构建