[发明专利]一种克伦特罗检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地，涉及一种检测尿液、动物组织(肌肉、心脏、肝脏)、血清、饲料等中的克伦特罗的酶联免疫试剂盒和其使用方法。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol，CLE)，俗称“瘦肉精”，化学名为“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐”，药品名为“克喘素”是一种β-兴奋剂。因其能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，并能加速动物生长，而被广泛添加于动物饲料中，并且可以残留在动物的体内。经大量实验结果证实，克伦特罗的毒性并不很强，但因其半衰期长，在体内代谢慢等原因，人体对其的耐受量非常小，治疗用药时也都十分慎重，用量过大或无病用药则会导致肌肉震颤、心悸、战栗、头痛、恶心、呕吐等症状。由于这种药物对人有严重的副作用，轻则导致心跳及心率不正常，重则可引发心脏病。目前，我国已禁止其使用。而在生产上，一些不法生产者在育肥猪(60～70Kg以上)饲料中添加，连用至宰前。由于克伦特罗饲用浓度是治疗用量的10倍以上，停药期短(如果停药造成受体调节减弱，脂肪在皮下和内脏补偿性蓄积，瘦肉率下降)，更重要的是它的化学结构比较稳定，因此在肝、肺等动物内脏器官残留量很大。另外，克伦特罗能耐受100℃高温，经126℃油煎5min才会破坏减半，常规烹调对肉食品中克伦特罗残留起不到破坏作用，因而人类食用后会发生中毒。

早在上世纪80年代就有学者开始对于克伦特罗的定量检测和分析研究，上述分析技术发展至今已经20余年。通常，检测克伦特罗的主要方法有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。这些方法由于仪器设备复杂、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等原因，不适合现场监控和大量样本筛查。

1993年Boyd等人(D.Boyd，P.Shearan.J.P.Hopkins andM.O’Keeffe.Application of matrix solid phase dispersion for the determinationof clenbuterol in liver samples[J]，Analytica Chimica Acta，1993，27(5)：221-226.)应用基质固相分散法与放免法结合对肝脏中克伦特罗残留作了检测。检测中用³H标记克伦特罗，检测限达0.5ng/g，回收率大于70％，上述方法的应用开创了免疫检测分析克伦特罗残留的先河。放免法检测克伦特罗残留具有很好的特异性和高度灵敏度。但由于对条件要求比较苛刻且放射性同位素对工作人员有一定伤害，因而限制了该法的广泛应用。

随后发展起来的荧光免疫分析法(FIA)同放免法相比，克服了放免法中的核辐射缺点。Bacigalupo等(M.A.Bacigalupo，A.Lus，G.Meroni Dovis andE Petruzzlli.Comparison of time-resolved fluroimmunoassay an dimmmunoenzymometricassay for clenbuterol[J].Analyst，1995，120(8)：2269-2271.)利用单抗技术与荧免分析技术检测了克伦特罗在牛尿中的残留，检测线性范围10～10⁵pg，检测限10pg。与色谱法相比，荧光免疫法检测克伦特罗残留具有特异性高，稳定性好，对样品处理要求比较简单及一次可检测多个样品等优点。缺点是对温度的强烈依赖性和荧光强度取决于激发波长。

标记免疫分析技术是“迈向21世纪的医学检验技术”之一，其发展趋势是：新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，可明显提高检测特异性，敏感度可达zepto(10^-20)、yocto(10^-24)水平，即可实现分子水平的检测。