[发明专利]栀子苷元的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种栀子苷元的制备方法；具体涉及一种用固定化酶在双相系统中转化栀子苷制备栀子苷元的方法。

背景技术

栀子来源于茜草科(Rubiaceae)植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，其性寒味苦，归心肺三焦经，具有泄火除烦，清热利尿，凉血解毒之功效等。中药栀子有效成分为以栀子苷为代表的环烯醚萜类物质。栀子苷(Geniposide，结构式如式1所示)又名京尼平苷，是用于治疗心脑血管、肝胆等疾病及糖尿病的原料药物，具有很高的药用价值。

研究表明，栀子苷必须在肠道内代谢为栀子苷元后才能发挥疗效。栀子苷元(京尼平，Genipin，结构式如式2所示)具有降压、消炎、抗血栓、抗肿瘤、抗衰老等药用功效，也是迄今为止所研究的环烯醚萜物质中抑制诱变剂诱变活性最强的物质。栀子苷元还可被应用于生物材料的交联，它不仅能形成稳定的交联制品，同时具有细胞毒性小，生物相容性好，抗降解能力强和应用领域广泛等优点，是很有前景的生物交联剂。目前在食品工业中越来越要求使用天然食用色素，栀子苷元可以与氨基酸在一定条件下生成栀子蓝色素，该色素性质稳定、色泽鲜明，且无毒、可食用，被应用于食品工业和作为生物检测显色剂，具有很高的商业价值。栀子苷元应用广泛，具有广阔的市场前景和应用价值。

糖苷水解酶又称糖苷酶，是一大类催化糖苷键水解的酶，在自然界中在普遍存在，来源于细菌、霉菌、杏仁、大豆、动物脏器等。栀子苷属于糖苷类物质，可以在糖苷水解酶的催化下水解生成葡萄糖和栀子苷元。β-葡萄糖苷酶和β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶。

由于栀子药材中几乎不含有栀子苷元，目前栀子苷元主要由栀子苷转化而得。栀子苷转化为栀子苷元的常规的方法主要为β-葡萄糖苷酶水解法。但是该方法中存在一些问题：首先，栀子苷元在水中的稳定性差，极易开环形成双醛基结构(如式3所示)，在水中长时间反应会影响其产率；其次，栀子苷元还会与氨基酸和蛋白质发生交联反应，生成栀子蓝色素(如式4所示)，而β-葡萄糖苷酶本身是一种蛋白质，因此在反应的过程中酶会与产物栀子苷元发生副反应，不仅使酶活大大降低甚至失活，而且会影响栀子苷元的产率；再次，β-葡萄糖苷酶市场价格昂贵，该方法中的β-葡萄糖苷酶用量高、且酶无法回收利用，生产成本高。由于存在以上问题，栀子苷元目前难以实现工业化生产，因此亟需改进现有方法的不足。

式1：栀子苷的结构式

式2：栀子苷元的结构式

式3：栀子苷元的水解反应式

式4：栀子苷元与氨基酸和蛋白质的交联反应式

式5：栀子苷元产率计算公式

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用固定化酶在双相系统中将栀子苷转化制备栀子苷元的方法。

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

(1)糖苷水解酶的固定化(交联-包埋法)：以终浓度为2～3％的海藻酸钠作载体对糖苷水解酶进行包埋，并且用0.5～1％的戊二醛交联，制成固定化糖苷水解酶，于4℃冰箱中保存备用。

(2)双相系统酶促反应：将固定化糖苷水解酶和栀子苷加入到pH为4.0～5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液和乙酸乙酯组成的双相系统中，在45～60℃温度条件下反应2.0～3.5h。

(3)分离：将固定化酶与反应液分离，并回收固定化酶，置于保4℃冰箱中保存。然后将反应液中的缓冲液层和乙酸乙酯层分离。

(4)萃取：将分离后的缓冲液层用乙酸乙酯(体积比为1∶1)萃取两次，并与反应液中的乙酸乙酯层合并；

(5)干燥：将合并后的乙酸乙酯萃取液用适量硫酸钠干燥20～40min；

(6)浓缩：减压旋蒸回收乙酸乙酯，浓缩至原来体积的1～5％。

(7)结晶：将浓缩后的液体置于-5～4℃条件下结晶，收集晶体。

(8)真空干燥：将晶体于30～50℃真空干燥1h，所得白色晶体即为栀子苷元为。

优选地，本发明上述利用固定化酶将栀子苷转化制备栀子苷元的方法之步骤(1)所使用的糖苷水解酶为β-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶，其的酶活力为200U/g-900U/g。

优选地，本发明上述利用固定化酶将栀子苷转化制备栀子苷元的方法之步骤(2)所使用的双相系统中，水相为醋酸-醋酸钠缓冲液，有机相为乙酸乙酯。