[发明专利]一种微乳液克隆扩增结合水凝胶微球芯片数字化检测微突变的方法

说明书

技术领域

本方法属于医学生物技术领域，涉及一种微乳液克隆扩增结合水凝胶微球芯片数字化检测微突变的方法。

背景技术

近年来，微突变检测在疾病的早期诊断中发挥着越来越重要的作用，成为疾病诊断的一种重要的手段。在疾病早期阶段，由于相关基因的突变体数目要远远少于正常的DNA分子，使得对于微突变体的检测变得很困难。在一些已有的检测微突变的技术中，DNA测序是一个比较经典的方法，但是这种方法不能够检测突变数量少于20％的样本。然而，通常癌症早期只有极小一部分DNA有突变，为了检测这种极少的突变，现今已经发展了许多方法，目前用于微突变检测的方法主要有：基于酶切或PCR的方法和以构象为基础的检测方法等。例如，用核酸内切酶V结合酶连的检测方法就可以克服上述的问题，使检测限度达到1％。但是这种方法不能检测到更低的突变，因为这种方法是基于模拟信号来定量的。一种被称为数字化克隆扩增的技术(Digital-PCR技术)，是一种极度精确的定量方法。该方法是将模板分散到多孔平板上，使得每个微孔中最多只含有一个突变体分子或者一个野生型模板分子，最后通过对扩增产物数字化计数来实现对微突变的精确定量。但是由于受限于平板上微孔的数目，检测的灵敏度也很难继续提高。为了增加单分子PCR扩增的微孔数，最近提出了一种新的技术，即乳液PCR技术，这种技术是将PCR扩增混合物包裹在油包水的微乳液中，可形成数以百万计的油包水的微囊结构，每个微囊也最多只含有一个突变体分子或者一个野生型模板分子，以及一个结合有PCR扩增引物的微球，通过微乳相PCR扩增，实现单分子克隆检测，即每个微球表面扩增的片段仅来源于一个模板分子。

但是，目前尚未有将微乳液克隆扩增与水凝胶微球芯片数字化检测结合来提高检测微突变灵敏度的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高灵敏度的微乳液克隆扩增结合水凝胶微球芯片数字化检测微突变的方法。

微乳液克隆扩增技术是一种新型的基因检测技术，具有高灵敏度和保真性，能够实现单分子扩增。我们在实现了这种技术的基础上，自创了一种新的检测平台，即微球水凝胶芯片技术数字化检测平台，发展了一种新型的微突变检测方法。

在本发明中，首先以片断化的DNA分子为模板，采用微乳液-微球扩增法同时进行百万个以上的PCR反应，每种PCR产物代表一个DNA分子(模板)，并且连接在一个微球上。运用水凝胶法制备微球芯片，使芯片上均匀地平铺一层高密度微球，并且水凝胶既能固定住微球，又能让互补DNA分子通过。通过将基因突变检测芯片与分别用于检测两种等位基因类型的两种荧光标记的探针杂交后计数不同颜色的微球，以确定样本基因突变数的变化，从而得出最后的诊断依据。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种检测微突变的方法，该方法是采用微球介导的微乳液克隆扩增技术结合水凝胶芯片固定微球荧光检测及数字化分析技术进行微突变检测的方法。

该方法中所述微球介导的微乳液克隆扩增技术是将片段化的DNA模板、表面固定有扩增引物的微球以及PCR反应体系的混合物分散并包裹在油包水的微乳液微囊中同时并列进行微乳液PCR扩增，微乳液PCR扩增后，破乳，收集微球，将微球上扩增出的双链目的片段制备成单链DNA扩增片段；

其中：

每个微囊最多仅包含一个片段化的DNA模板分子、一个微球和PCR反应体系的混合物；

每个微球表面只固定一种扩增引物，固定的扩增引物是与片段化的DNA模板对应的一种基因特异性引物或者是与片段化的DNA模板对应的用于PCR扩增的一种公用引物；(由于直接采用特异性引物进行扩增，如果扩增的产物中存在多种突变类型，则荧光探针识别的序列需对应相应的SNP，无法使用相同序列，成本较高；而采用公用引物扩增的产物中不同的突变类型可以采用相同或不同的荧光探针识别序列，当采用相同序列时成本较低，可计算总突变率，如需分别计算不同突变类型的突变率，也可采用不同识别序列。)

PCR反应体系中的扩增引物含有与微球表面固定的扩增引物成对的引物；最好的选择是除了含有较多的与微球表面固定的扩增引物成对的引物外，还含有少量微球表面固定的扩增引物。比如，固定在微球表面的是正向引物，则PCR反应体系中含有少量正向引物和大量反向引物，正向引物与反向引物数量比最优为1∶10～1∶20，PCR反应体系中含有少量正向引物易于启动PCR反应。