[发明专利]组织培养铁皮石斛类原球茎的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，因老茎茎节处呈褐色，又名黑节草，是一种集观赏和药用于一身的名贵珍稀草本植物，具有独特的药用价值，为石斛之极品。石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，其性味甘淡、微咸，性属清润，清中有补，补中有清。早在东汉时期的《神农本草经》中已记载石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，为历代帝王梦寐以求的宝物，素有“千金草”之称，驰名中外，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”，民间称其为“救命仙草”。现代药理学研究表明，石斛多糖具有增强T细胞及巨噬细胞免疫活性的作用，是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。

铁皮石斛常附生于树木或岩石上，植株比较矮小，生长发育缓慢，叶片面积小、光合面积小、强度低，尤其是种子极小，胚具后熟现象，因此自然条件下种子难以萌发(萌发率低于5％)。在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要3～4年，常需与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。

国内外学者开展了对野生铁皮石斛全面的研究，包括化学成分，药理活性，人工种植等方面的研究。而铁皮石斛的培养主要集中在愈伤组织诱导、基本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。铁皮石斛试管苗的繁殖一般要经过类原球茎(protocorm-like bodies，即PLBs)阶段，而类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与原植株相同的物质代谢和形态发育潜能。鉴于此，人们提出用类原球茎代替原植株成为新药源的可能性。然而，已有的研究结果表明，从铁皮石斛不同部位诱导出类原球茎的研究还存在诱导率低、分化快和褐变等问题尚没有解决，目前还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决铁皮石斛类原球茎诱导和增殖以及代谢产物控制中存在的疑点和难点，从而影响了铁皮石斛的深入研究和开发。

天然铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此研究铁皮石斛类原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快，石斛多糖含量高的组织培养铁皮石斛类原球茎的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤：

a、植物体的选择及无菌处理：

选择6～8月份生长的铁皮石斛野生新鲜植株，除去根和叶进行清洗和无菌处理，选取实生苗的幼茎，将幼茎剪成0.3～0.5cm²大小铁皮石斛组织；

b、组织诱导培养：

将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期：10～24天，培养温度：10～30℃，光照时间：1～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m²·s；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖0～50g/L+琼脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0；

c、大规模培养：

将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10～24天，培养温度：10～30℃，光照时间：0～24小时/天，光照强度：0～100μmol/m²·s；所述的大规模培养基为：MS培养基+蔗糖20～50g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0。

作为本发明组织培养铁皮石斛类原球茎的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。