[发明专利]制备多能干细胞的材料和方法

说明书

技术领域

本发明涉及普遍的细胞生物学领域。更具体地说，涉及到多能性干细胞的繁殖，培养条件和材料，促进传播和利用干细胞。

技术背景

为了便于读者的理解，提供下面的说明。不能将说明提供的信息或者所引用的参考看做本发明的现有技术。

干细胞具有自我更新能力，可无限分化，并在适当情况下，分化成不同类型细胞。胚胎干细胞（ES细胞）从早期胚胎建立，可以长时间培养，同时保持多能分化成各种活体细胞的能力。相比之下，成体干细胞位于已发育的器官中，有能力分裂并创造其他细胞。

Thomson等(U.S.Pat.No.5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)首次成功分离和增殖灵长类动物多能干细胞。他们随后由人类囊胚细胞系获得人类胚胎干细胞（hES）(Science 282:114,1998)。Gearhart和同事由胎儿性腺组织获得人类胚胎生殖细胞系（hEG）(Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998；U.S.Pat.No.6,090,622)。hES和hEG细胞具有多能性干细胞的特点，即他们可以持续培养不会分化，他们有一个正常的染色体和核型，可生产一些重要的细胞。

诱导多能干细胞（iPS）来自非多能干细胞，通常是成人体细胞经人工改造的多能干细胞。2006年，山中等用四个基因（OCT-4，SOX2的，c-MYC，KLF4）转染小鼠成纤维细胞获得iPS细胞。随后，从人类成人体细胞获得了iPS细胞。(Takahashi et al.Cell,131:861-872(2007);Yu et al.Science,318:1917-1920,2007).

再生医学领域旨在帮助修补，更换，或再生受损的细胞，组织或器官。干细胞疗法有望治疗多种疾病，包括老年痴呆症，帕金森氏症，中风，脊髓损伤，心脏病，肾功能衰竭，骨质疏松，I型糖尿病，多发性硬化症，风湿性关节炎，烧伤和创伤。然而，这种治疗方法的进展受到了重重阻碍，其中包括胚胎干细胞的供体与受体免疫不相容，有可能引起免疫排斥反应。

发明内容

本发明涉及生成干细胞的方法。一方面，本发明为取得诱导多能干细胞的方法，即在羊膜上皮细胞滋养层上培养一个或多个体细胞。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞是哺乳动物羊膜上皮细胞。在一个实施方式中，哺乳动物的羊膜上皮细胞来自：人，猪，狗，马，牛，羊，鼠和其它啮齿类等哺乳动物。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞(hAEC)。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞培养不超过6代（P0–P5）。在一个实施方式中，羊膜上皮细胞为新分离的P0羊膜上皮细胞。

在一个实施方式中，体细胞选自：成人皮肤成纤维细胞（ADSF），人类胚胎成纤维细胞（HEF），小鼠成纤维细胞（MF），小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），猪成纤维细胞（PF），猪胚胎成纤维细胞（PEF）。在一个实施方式中，体细胞是成人皮肤成纤维细胞（ADSF）。

在一个实施方式中，细胞培养采用KO-DMEM培养液。在一个实施方式中，KO-DMEM培养液中包括β-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)，人脐静脉血清或小牛血清或胎牛血清和LIF(白血病抑制因子)。

在说明性实施方式中，KO-DMEM培养液由10ng/mlβ-FGF，5％人脐血和12ng/ml LIF。

一方面，本发明提供了按照上述方法得到的诱导多能干细胞。一方面，本发明提供了多能干细胞诱导的分化的体细胞。

一方面，本发明提供了一个干细胞治疗方法,包括：（1）分离和收集病人的体细胞或动物体细胞；（2）体细胞重编程为多能干细胞；（3）多能性干细胞的诱导分化；（4）移植来源于病人或动物的分化细胞；以及（5）多能干细胞用于再生和/或组织工程或育种。

附图说明

图1是显示成人皮肤成纤维细胞（ADSF）在人羊膜上皮细胞(hAEC)滋养层培养的显微图片。观察7天后，出现外观上类似胚胎干细胞的细胞克隆。

图2是ADSF细胞在hAEC滋养层上培养7天的克隆球干细胞标记物染色的一系列显微照片。结果显示，得到的细胞表达OCT-4,NANOG，SSEA-4,KLF4,C-MYC,TAR-81,TAR-60等常见的干细胞标记。

图3A,3B,3C表示培养7天ADSF-iPS细胞标记物定量表达及比较。

图4A,4B,4C显示了经过12天培养的各类细胞的干细胞标记物定量表达。