[发明专利]新的锌指核酸酶及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于靶向切割和改变基因组序列、靶向切割后在外源多核苷酸和基因组序列之间发生同源重组，或者靶向切割后发生非同源性末端连接的方法和组合物。

背景技术

限制性酶是基因工程和分子生物学中不可或缺的工具。致力于创造识别并切割9个或更多个碱基对(bp)的特定DNA序列的、被称为“稀有切点酶(rare cutter)”的新的限制性酶。其中，锌指核酸酶技术的作用为利用限制性酶来识别并切割多种DNA碱基序列，该限制性酶是由锌指DNA-识别结构域和DNA-切割结构域组成的嵌合核酸酶。锌指核酸酶可用来在在哺乳动物、植物或其它生物中进行有效的遗传修饰，这是因为当将这种酶导入细胞中时，它能在基因组DNA中产生定向的双链断裂(DSB)。当细胞发生双链断裂时，受损的区域由细胞的自我修复系统进行修复。此时，将与受损区域具有相似DNA序列的供体DNA导入细胞中，能导致受损DNA和供体模板之间发生同源重组(HR)。为了对基因组的特定位点进行所需的修饰，将靶碱基序列并入供体DNA中。同时，在不存在供体DNA的情况下，受损细胞可以通过非同源性末端连接(NHEJ)来修复。非同源性末端连接(NHEJ)通过将两个断裂末端连接到一起来修复受损的DNA，并且通常不会产生突变。然而，在某些情况下，修复易于出错，导致断裂的DNA末端处发生碱基对的插入或缺失。总的来说，由锌指核酸酶导致的特定碱基序列的双链断裂引起非同源性末端连接，因此所得的DNA含有突变，进而产生敲除细胞系。

真核生物基因组所编码的最丰富的DNA-结合基序——锌指(ZF)，提供了可能是最好理解的蛋白质-DNA结合机制中的一种(Wolfe，S.A.et al.，(2000)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，29，183-212；Pabo，C.O.et al.，(2001)Annu.Rev.Biochem.，70，313-340；Moore，M.et al.，(2003)BriefFunct.Genomic.Proteomic.，1，342-355和Klug，A.et al.，(2005)FEBS Lett.，579，892-894)。工程锌指蛋白(ZFP)极可能作为基因调控和基因组修饰的工具，因为它们可以用于靶向几乎在任何基因组的任何期望位置的功能性结构域。锌指蛋白为设计具有新DNA-结合特异性的蛋白质提供了通用框架，这是由于它们具有模块结构特征，并且当识别DNA碱基序列时，在碱基与氨基酸残基之间具有碱基特异的相互作用。