[发明专利]新的锌指核酸酶及其用途

权利要求书

1.融合蛋白锌指核酸酶，其包含锌指结构域和核苷酸切割结构域，其中所述锌指结构域包含三个或更多个锌指模块，

两个或更多个所述锌指模块来源于天然存在的、野生型的锌指模块，和

所述融合蛋白识别并切割细胞染色质中包含目的区域的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的锌指核酸酶，其中所述锌指结构域包含三个或四个锌指模块。

3.如权利要求1所述的锌指核酸酶，其中所述锌指模块是图1所描述的模块中的任何一个。

4.如权利要求1所述的锌指核酸酶，其中所述锌指核酸酶以二聚体的形式发挥切割核苷酸序列的作用。

5.如权利要求4所述的锌指核酸酶，其中所述锌指核酸酶是表2所描述的核酸酶中的任何一个。

6.如权利要求1所述的锌指核酸酶，其中所述核苷酸切割结构域是IIS型限制性内切核酸酶。

7.如权利要求6所述的锌指核酸酶，其中所述IIS型限制性内切核酸酶是FokI。

8.用于切割、替换或修饰靶区域中的核苷酸序列的试剂盒，包含一对或多对权利要求1所述的锌指核酸酶。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述锌指核酸酶对是相同或不同的锌指结构域。

10.如权利要求8所述的试剂盒，所述锌指模块是图1所描述的模块中的任何一个。

11.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述锌指核酸酶对是表2所描述的核酸酶中的任何一个。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述核苷酸切割结构域是IIS型限制性内切核酸酶。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述IIS型限制性内切核酸酶是FokI。

14.产生锌指核酸酶的方法，包括以下步骤：

(a)选择目的区域中的核苷酸序列；

(b)选择与所述序列结合的锌指模块并工程改造锌指结构域，其中所述锌指结构域包含三个或更多个锌指模块，两个或更多个所述锌指模块来源于天然存在的、野生型的锌指模块；以及

(c)表达包含锌指结构域和核苷酸切割结构域的融合蛋白。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述锌指结构域包含三个或四个锌指模块。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述锌指模块是图1所描述的模块中的任何一个。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述锌指核酸酶以二聚体的形式发挥切割核苷酸序列的作用。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述锌指核酸酶对是表2所描述的核酸酶中的任何一个。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述核苷酸切割结构域是IIS型限制性内切核酸酶。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述IIS型限制性内切核酸酶是FokI。

21.切割目的区域中的核苷酸的方法，包括以下步骤：

(a)选择目的区域中的第一核苷酸序列；

(b)选择与第一核苷酸序列结合的权利要求1的第一锌指核酸酶；

(c)在包含所述核苷酸序列的细胞内或细胞外表达所述第一锌指核酸酶，从而将所述核酸酶导入所述细胞中；以及

(d)使所述第一锌指核酸酶(其在细胞内表达或被导入细胞)与所述序列结合，以便切割目的区域中的细胞染色质。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述第一锌指核酸酶包含第一锌指结构域和第一核苷酸切割结构域，

(e)在包含所述核苷酸序列的细胞内或细胞外选择并表达第二锌指核酸酶，从而将所述核酸酶导入所述细胞中，其中所述第二锌指核酸酶包含第二锌指结构域和第二核苷酸切割结构域；以及

(f)使所述第二锌指核酸酶(其在细胞内表达或被导入细胞)与所述目的区域中的第二核苷酸序列结合，其中所述第二序列与所述第一锌指核酸酶所结合的所述第一核苷酸序列之间的距离为2-50个核苷酸。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述切割在所述第一和第二核苷酸序列之间发生。