[发明专利]等位基因的偏向扩增

说明书

本申请要求美国专利临时申请第61/112,495号和第61/117,371号的优先权，其全文通过引用纳入本文。

发明背景

人类基因组计划(human genome project)已经成功完成人类DNA大多数区域的测序。疾病相关基因和序列改变的鉴定工作继续快速推进。采用连锁研究将表型和遗传标记例如简单序列重复(simple sequence repeats)或单核苷酸多态性(SNP)关联以鉴定候选基因。序列改变包括导致错义、框架移动或剪接突变的SNP、插入、和缺失，因此可用来精确定出负责突变的基因和范围。

然而，即使已知遗传细节，这钟知识仍难以用于常规医学实践，很大程度上是因为分析DNA的方法昂贵且复杂。当成本显著降低且方法明显简化时，预期DNA分析将能用于日常临床实践而有效检测疾病检测和更好的治疗。理想的DNA分析是快速、简便、且价廉的。

当疾病由数量有限的突变所造成时，或当少许序列变化造成大部分的疾病案例时，直接基因分型是可行的。传统方法的范围从PCR产物的限制性消化到封闭管荧光方法。DNA分析的封闭管方法可简单易行。PCR一旦启动，不再需要添加试剂或分离。然而，当一种等位基因少量存在时，该等位基因可能难以检测出。

目前鉴定序列变异的最佳方法是测序。尽管其成本在降低，测序仍然是一种复杂的过程，在用于具体的遗传诊断或或药物遗传学时并不快速、简便、或价廉。标准的测序需要七步：1)通过PCR扩增，2)清洁PCR产物，3)加入循环测序试剂，4)进行双脱氧终止的循环测序，5)清洁终止产物，6)通过电泳分离，和7)数据分析。这一复杂过程可以自动化并已在一些测序中心实现，但其测序复杂性仍远高于本发明所述方法。此外，当分析大的或者多个基因时，返回的测序产物经常有超过90％是正常产物。而且，现有的测序方法无法鉴定低拷贝等位基因，特别是当等位基因在等位基因中的占比低于20％时。鉴定这些低拷贝等位基因的存在对许多情况，例如鉴定肿瘤样品或外周液体如血液中某些癌基因的突变或变化至关重要。这些等位基因的存在与否对于治疗方案的选择特别重要，例如当检测/证实为常见体细胞突变(p53、EGFR、BRAF)和早期鉴定为突变细菌感染(例如疟疾)时禁用标准疗法。相对占优的野生型背景中能发现低水平突变等位基因的其它例子是在线粒体DNA中和存在于母体循环内的胎儿DNA。此外，需要检测低水平的外遗传突变。例如，近来发现BRCA1启动子1-10％之间的甲基化与乳腺癌表型相关(Snell等，2008，Breast Cancer Research)。

已知基于PCR的技术用于富集样品中含量较少的等位基因和突变的组分。当突变的基因型未知时，可采用COLD-PCR(Li J等，Nat Med 2008；14：579-84)。这种技术可检测出比例低至1∶100的突变等位基因与野生型基因。然而，由于其非特异性并检测产生的任何变异，必需用其它分析鉴定产物。对于富集已知SNP，一些最常用的技术是：ARMS(Newton CR等，Nucleic Acids Res 1989；17：2503-16)、PNA介导的PCR(Nielsen PE等，Science 1991；254：1497-500；Dabritz J等，Br J Cancer 2005；92：405-12)、LNA介导的WTB-PCR(Dominguez PL和Kolodney MS.Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.(检测临床样本中含量较少的单核苷酸突变的野生型阻断聚合酶链反应)Oncogene 2005；24：6830-4)、MAMA-PCR(Cha RS等，PCR Methods Appl 1992；2：14-20)、TaqMAMA(Li B等，Genomics 2004；83：311-20；Easterday WR等，Biotechniques 2005；38：731-5)、和SCORPION引物(Whitcombe D等，Nat Biotechnol 1999；17：804-7)。这些方法通过等位基因特异性PCR检测突变、注意到定量循环(ΔCq)的差异并能检测1∶1000比例的突变等位基因与野生型。