[发明专利]等位基因的偏向扩增

权利要求书

1.一种扩增和检测生物样品中等位基因的方法，其中所述生物样品包含靶核酸的第一等位基因和第二等位基因，存在的第一等位基因浓度高于第二等位基因，该方法包括以下步骤：

在生物样品中加入热稳定性聚合酶、探针和为扩增生物样品中靶核酸设置的引物对，其中设置的探针与靶核酸杂交，所述探针与第一等位基因杂交时具有第一Tm，与第二等位基因杂交时具有第二Tm，其中第一Tm高于第二Tm，

通过在变性温度与退火温度之间的热循环扩增生物样品中的靶核酸，其中退火温度低于第一Tm，以及

检测第二等位基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述退火温度在第二Tm与第一Tm之间约一半处。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述退火温度比第二Tm至少高1.0℃。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述退火温度比第二Tm至少高2.0℃。

5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述退火温度大约等于第二Tm。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所选择的退火温度应使单链平衡偏向错配的探针:扩增子杂交，超过匹配的探针:扩增子杂交。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述热循环包括退火和变性温度之间的温度变化速率至少为4℃/秒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述热循环包括退火与变性温度之间的温度变化速率至少为6℃/秒。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是不具无外切活性的exo^-聚合酶。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二等位基因的等位基因占比为5％或更低。

11.如权利要求1-110中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二等位基因的等位基因占比为3％或更低。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二等位基因的等位基因占比为1.5％或更低。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一等位基因为野生型。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，通过解链曲线分析，检测所述第一等位基因和第二等位基因。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述解链曲线分析包括采用饱和染料的高分辨率解链。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述解链曲线分析包括检测未标记探针的解链。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括分析扩增交叉点。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括检测第一等位基因。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括计算第一等位基因和第二等位基因的等位基因占比。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述计算步骤包括按F_m＝w_Lf(T_L)+w_Hf(T_H)估算第二等位基因的占比，其中w_L和w_H是权重而f(T_L)和f(T_H)是从第一等位基因与第二等位基因各自的纯合子和第一等位基因与第二等位基因50∶50混合物的标准品计算出的各温度峰的各个估算值。

21.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述探针是连接于引物对之一5’末端的探针元件。