[发明专利]纯化核酸、特别是来自固定组织的核酸的方法

说明书

本发明涉及纯化核酸的方法、实施本发明方法的系统以及用于纯化生物试样的试样容器夹持器。

近来，分子诊断学的重要性日益增加。分子诊断学已经开始应用于临床诊断疾病(其中包括检测感染病原体，检测基因变异，发现循环肿瘤细胞和鉴别疾病遗传因素的风险因子等)。但是，分子诊断学的方法同时也应用于兽用药、环境分析和营养物质测试中。另一应用领域为在病理学/细胞学研究所的研究或者在法医询查范围内的研究。同时在保健领域(例如研究库存血的感染病原体-自由度(Infektionserreger-Freiheit))也使用基因诊断学，立法者计划在将来用法律规范这些测试。在临床分子诊断学中应用的方法(如杂交或扩增技术如PCR(聚合酶链式反应)，TMA(转录介导的扩增)，LCR(连接酶链反应)、bDNA(分支DNA)或NASBA(基于核酸序列的扩增)-技术)在基础科学研究工作中也属于常规方法。

特别地，核酸分析通过确定组织中的基因表达在肿瘤疾病的研究和诊断中开启了充满前景的新的可能性。因此，例如，所谓微阵列系统已经开启了在单个反应装置中确定上百或甚至上千个基因表达的可能性。将试样材料、纯化的核酸(如RNA或cDNA)施用至芯片，该芯片包括相应的捕捉寡聚核苷酸，从而该试样中的核酸可以通过杂交而被检测。此外，其他在试样中检测核酸的方法，例如扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)，也是普遍使用的。

核酸分析中的基本问题是试样制备。待研究的试样通常包括含干扰性、部分不可溶的成分(所谓的碎片(Debris))的细胞或组织，这些成分会干扰后续的分离和分析。这些不可溶的成分特别出现在从粪便/排泄物、血液、疣、钙化组织(骨)或其他严重坏死组织中分离核酸时。然而，碎片在其最广泛意义上也包括可溶性成分，例如从红细胞释放的血红蛋白，其严重过量的存在，并且会在分离核酸期间除去。

特别是在肿瘤诊断学中这些问题加剧严重，因为此时常常使用甲醛固定的、石蜡包埋的切片(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE-Schnitte)作为试样材料。当如在活组织检查期间从患者取试样时，或者在外科手术中取肿瘤物质的试样时，组织材料用甲醛固定，并包埋入石蜡中，从而可以保存该试样材料。在培育期间，同样之后在组织块(Gewebeblock)中的多年，固定接(Fixantien)造成生物分子的严重交联(核酸与蛋白质，蛋白质彼此之间，或核酸彼此之间)。这些交联结构的内部和外部细胞有助于生成不溶性碎片，或不可裂解或难以裂解的碎片。通常从这些包埋在石蜡中的试样制备切片供病理学家评估；然而，这些切片同样能够用作核酸分析中的起始材料。在这种情况中，细胞碎片和石蜡必须在裂解后的核酸纯化期间被除去。

此外，涉及干扰性的、部分不溶性成分(碎片)的问题也会在纯化来自粪便试样(排泄物、粪便(Kot))期间发生。粪便试样不仅包括食物的难消化成分(粗粮)，还包括未消化的剩余物，如脂肪、淀粉、结缔组织纤维和肌肉纤维和水，它们在大肠的上部不被吸收。存在的内源物质包括：脱落的肠细胞、消化酶的剩余物和粘液。此外，少量的胆汁本身、以及也会从胆囊排出以保护肠粘膜的少量的卵磷脂以及少量的其他磷脂会随动物粪便一起排出。

为了降低成本并保持从试样制备到测定分析结果的时间尽可能短，重要的目的是使纯化核酸的方法尽可能有效，并且尽可能通过自动化手段实施该方法。这特别适用于诊断学。高度适于自动化的方法是那些能够在尽可能少的不同反应容器中进行的并可以以标准化形式(例如，96孔板形式)进行的方法，因为可以在该方法中使用高效的移液自动装置。因此，在现有技术中存在对简单、高效和高度自动化的试样制备方法的需求。

常见的核酸纯化方法包括在离液序列高的条件下裂解试样、提取纯化、沉降和从液相例如苯酚-氯仿提取液纯化(参见Sambrook等人，Molecular cloning-a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，2001，ISBN-13：978-0879695774)，或基于柱的纯化方法，如在WO 2003040364-A1中记载的。