[发明专利]使用含有突变RXXD基序的二鸟苷酸环化酶酶促生产环二鸟苷单磷酸的方法

说明书

发明领域

本发明涉及在二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下通过两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的酶促合成的领域。特别地，本发明涉及提供大规模来源的DGC。此外，本发明涉及工业规模的c-di-GMP的生产。

发明背景

环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是细菌的第二信使，其参与生物膜形成、抗生素抗性和病原性细菌在其动物宿主体内的持久性。

因此，WO2005/030186涉及c-di-GMP在用于减弱微生物病原体的毒性或用于抑制或减少由微生物病原体的定居的方法中的用途。US2005/0203051涉及c-di-GMP用于抑制癌细胞增殖或增加癌细胞凋亡的用途。US2006/0040887涉及c-di-GMP用于刺激或增强病人的免疫或炎症反应，或者作为疫苗的佐剂以增强对疫苗的免疫反应的用途。此外，EP1782826涉及如c-di-GMP这样的化合物作为治疗性或预防性接种疫苗的佐剂的用途，及其在药物组合物(如疫苗)中的用途。进一步关注的是该化合物作为活性成分在多种传染性疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、肿瘤、过敏和生育率控制中的用途。

对于这些用途，通过化学合成来生产c-di-GMP。所述合成的参考文献是Hayakawa等，Tetrahedron 59(2003)，6465-6471。该文献显示了各种合成步骤中的低产量，这也被另一篇参考文献中的作者证实：即Hyodo和Hayakawa，Bull.Chem.Soc.Jpn.，77，2089-2093(2004)。然而，尽管上述方法声称对之前方法的很低的总产量有了一定改进，但明确的是，其中的几个步骤仍然显示出产物的重大损失，并且总产量也并不使人印象深刻，即低于25％。由于c-di-GMP的合成涉及在整个分子中使用相对高数量的保护基这一事实，后一种方法将特别受到阻碍。其合成和全部去除呈现出困难。

希望能够不使用保护基而生产c-di-GMP，例如，通过酶促合成。这将解决由化学合成必然带来的一些缺陷，如多步骤合成带来的不是最满意的总产量。如M.Christen Mechanisms of c-di-GMP signaling(PhD Thesis 2007)，p135公开的：因为这两个结构单元的复杂合成，c-di-GMP的化学合成没有显著的商业价值。

然而，时至今日c-di-GMP的酶促合成仍然不适于实际的、商业规模的生产。其可以以实验室规模合成，产生分析量，可通过HPLC证明其存在，不过通过例如NMR的结构鉴定和产量没有被公开。虽然从HPLC获得化合物的技术本身没有阻止实际的、工业规模的生产，如通过制备性HPLC，但是目前c-di-GMP的酶促合成却不能扩大规模。

目前的酶促合成，类似于c-di-GMP的天然合成，包括在二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下，两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联。这个过程受到产物反馈抑制的阻碍。据认为di-c-GMP的变构结合位点负责DGC的非竞争性产品抑制。鉴于此，M.Christen(2007)研究了不同的DGC突变体，帮助解释c-di-GMP信号机制。

鉴定了DGC突变体，其中被发现是核心c-di-GMP结合位点的RXXD基序得以改变，例如在新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)DgcA(CC3285)蛋白中，从R153E154S155D156变为V153M154G155G156。在此，根据氨基酸的国际单字母命名法，R表示精氨酸，E表示谷氨酸，S表示丝氨酸，D表示天冬氨酸，V表示缬氨酸，M表示蛋氨酸，以及G表示甘氨酸。因而，通过防止反馈抑制，可以获得一些产量的提高，所公开的合成通常导致毫克级的实验室规模的生产，而且没有使得可以以实际的、工业规模来生产c-di-GMP。

因此，期望提供一种改进的c-di-GMP酶促合成，特别是可以以适用于商业生产的实际的、工业规模来进行，并且更特别地，以高产量和高纯度来进行的酶促合成。

发明概述

为了更好地解决一个或多个前述的期望，在一个实施方案中，本发明呈现了含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)，例如新月柄杆菌DgcA(CC3285)氨基酸序列V153M154G155G156，其中以包含体的形式提供DGC。