[发明专利]经改进的核黄素生产

说明书

本发明提供了经改进的核黄素生物技术生产，所述生产通过在含有核黄素生物合成基因的操纵子(rib操纵子)中进行的修饰，特别是相应的核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游前导序列(rib前导区)的/在相应的核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游前导序列(rib前导区)中的修饰来完成。另外，本发明涉及带有所述经修饰的序列的经遗传改造的微生物，产生所述经修饰的序列/微生物的方法，及其用于生产核黄素的用途。

核黄素由所有植物和许多微生物合成，但是不被高等动物所生产。核黄素是基础代谢必需的，因为它是碳水化合物的酶促氧化中需要的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体。在高等动物中，核黄素供应不足可引起脱发、皮肤炎症、视力衰退和生长障碍(growth failure)。

核黄素的生物合成从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖开始。涉及核黄素生物合成的基因已知来自多种来源，例如Bacillus subtilis，Ereothecium ashbyii，Ashbya gossypii，Candida flareri，Saccharomyces cerevisiae，E.coli(见例如EP 405370或Ullman′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，7^th Edition，2007，Chapter Vitamins)。

以Bacillus subtilis中的情况作为生产核黄素的(微)生物的一个例子，涉及核黄素生物合成的基因包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH。ribA基因编码两种酶活性，即催化核黄素生物合成中第一步的GTP环式水解酶II和催化5-磷酸核糖体转化成4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮(DHBP)的4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮合酶(DHBPS)。脱氨酶和还原酶由操纵子的第一个基因ribG(ribD)编码。核黄素生物合成的倒数第二步由2，4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶催化，所述2，4-二氧四氢蝶啶是ribH的基因产物。催化途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB(ribD)编码。位于rib操纵子3′端的ribT的功能目前是不清楚的；然而，其基因产物不是核黄素合成所必需的。

核黄素操纵子从rib启动子(P_rib)起的转录由核糖开关(riboswitch)控制，所述核糖开关涉及位于rib操纵子5′区中几乎300个核苷酸的非翻译调节前导区(下文中称作rib前导区)，所述非翻译调节前导区在操纵子中第一个基因ribG的转录起点和翻译起始密码子之间。根据使用Bacillus subtilis的研究已知，rib前导区内至少三个不同的部分涉及rib操纵子的转录调节：(i)位于rib前导区3′-端的rho-非依赖性终止子，其包含反向重复，所述反向重复之后是rho-非依赖性转录终止或弱化结构特征性的多聚-T段(Kil et al.，Mol.Gen.Genet.233，483-486，1992；Mironov et al.，Mol.Biol.24，256-261，1990)；(ii)提示发挥反终止子功能的终止子5′-半边的反向重复(Mironov et al.，Cell 111，747-756，2002)；(iii)推测发挥反-反终止子作用，防止反终止子与终止子碱基配对，并且干扰反终止结构形成的，位于终止子中心部分并且彼此反向互补的两个元件(Mironov et al.，Cell 111(5)：747-56，2002)。体外转录研究已经证实，终止子的功能取决于转录实验中FMN的存在(Winkler et al.，PNAS 99(25)：15908-13，2002)。对例如SEQ ID NO：1中展示的B.subtilis的rib操纵子而言，分别地，终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸230到263组成，反终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸30到37组成，反-反终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸157到164组成。