[发明专利]促进靶miRNA生产的两亲肽和调控靶miRNA生产的方法

说明书

技术领域

本发明涉及促进靶miRNA生产的两亲肽和使用该两亲肽调控靶miRNA生产的方法。

2.背景技术

将编码的DNA翻译成蛋白质的RNA被称为信使RNA(mRNA)，其只占总RNA的2％。剩下的RNA(98％)为非编码的RNA。这些不翻译成蛋白质的RNA被认为是不重要的，并且它们的功能大多也是未知的。然而，已有这种非编码RNA的重要功能报道，即通过和基因或蛋白质形成复合物，或作为被称为核糖酶(ribozyme)的酶行使功能。目前，已有这些非编码RNA通过特异性地与基因或基因产物互相作用的调控功能报道。因此，了解这些非编码RNA的不同功能和特征变得更为重要。这种小分子量非编码RNA被称为内源小RNA(miRNA)或核糖开关(riboswitch)，其控制超过2％的所有基因的调控功能。

最为公知的非编码RNA为小RNA(miRNA)，在人类中有大约700中不同的miRNA。miRNA是一种单链的RNA分子，由19～25个核苷酸组成。miRNA产生于内源的发夹状转录本(Bartel，D.P.，Cell 116：281-297，2004；Kim，V.N.，Mol.Cells.19：1-15，2005)。miRNA互补结合到靶mRNA上，作为转录后基因抑制子行使功能，导致翻 译被抑制，并且还降解mRNA。也有报道认为miRNA可能和癌症有关。在一些报道中，一些miRNA已经表现出与癌症的发展或其代谢有关。因此，研究miRNA的功能正被认为是癌症生物学中新的和重要的领域(Esquela-kerscher，A et al.，Nat.Rev.Cancer 6(4)：259-269，2006)。此外，miRNA的表达水平在细胞发育和分化过程中变化很大。miRNA在发育系统和疾病状态中的重要性已经被miRNA表达谱图(profiling)证实(Lu，J.et al.，Nature 435：834-838，2005)。研究表明，一种miRNA即let7a-1与肺癌或结肠癌有关，miR16-1与白血病或前列腺癌有关，miR24-1与白血病有关，而且let7a-1通过抑制RAS基因抑制一般的癌症促进基因因子。至于miR16-1，能通过抑制致癌因子Bc12抑制癌细胞的生长。因此，发现一种能调控miRNA数量的方法和试剂将会是一种有效目标治疗药物的候选方案(candidate)。总之，我们可以通过抑制引起目标疾病的miRNA和激活抑制疾病的miRNA来促进对疾病的抑制。

在体内有两种酶与miRNA的生产有关。一种被称为Drosha，为细胞核内的核酸内切酶。第二种为Dicer，为细胞溶质(cytosol)中的核酸内切酶。这两种酶为RNA水解酶，无碱基序列的特异性。通过识别用于消化的双链RNA的长度，使它们具有有限的特异性。最初的miRNA(miRNA前体)通过细胞核中的RNaseIII型Drosha酶形成大约70～90个核苷酸长度的茎环结构miRNA前体。然后，miRNA前体进入到细胞溶质，被Dicer酶切成更短的21～25个核苷酸的miRNA，称为成熟miRNA。

既然miRNA的生产受这两种酶的调控，因此理解这两种酶的特异性对于miRNA生产是非常重要目标。如果靶miRNA引起如癌症那样的疾病，这两种酶将可能是用于扩增或减少引起疾病的miRNA的很好靶蛋白。特别地，细胞溶质中加工miRNA的Dicer被认为是重要的靶标，因为它可在细胞溶质中直接与靶mRNA互作。

然而，Dicer的问题在于该酶的加工是非特异性的，并且对miRNA前体的碱基序列无选择性。另一个加工miRNA的酶Drosha具有与底物结合的分子伴侣(chaperon)蛋白质，因此，有助于使非特异的底物变得更为特异。然而，Dicer具有识别发夹状底物的茎长度的特异性，而对超过700种其它发夹状内源底物缺乏特异性识别的能力。在体内，特异性地使miRNA成熟的调控因子是很关键的，但到目前为止还没有这类调控因子的报道。

因此，本发明的发明人对能特异性地结合靶miRNA前体的配体开展了大量的研究，而且该配体有助于通过添加人造元素诱导使对miRNA前体的碱基序列不特异的Dicer酶产生特异性而生产成熟的miRNA。在研究过程中本发明的发明人已经证实，通过取代在疏水区具有吲哚基的色氨酸而构建的两亲肽与靶miRNA前体形成紧密的特异性互作。这种特异性互作促进了Dicer酶的活性，并特异性地增加了成熟miRNA的生产，由此完成了本发明。

发明详述