[发明专利]蛋白质的重折叠方法

说明书

技术领域

本发明涉及在因为经不溶化处理的或是失去了高级结构而失去了活性和稳定性的蛋白质中恢复天然状态的高级结构的方法(重折叠方法)。

背景技术

使用大肠菌等作为生产宿主来生产基因重组蛋白质，得到在水中不溶性变性的蛋白质。这样的蛋白质也叫做变性蛋白质。因为变性蛋白质失去了活性和稳定性，故在将此蛋白质作为医药品等使用时，必须进行引导以使其具有天然状态的高级结构。已知蛋白质的重折叠方法可以作为在此种场合下使用的方法。

但是，因为在此重折叠中使用的试剂和操作方法，必须根据蛋白质进行适当地选择，故对没有重折叠经验的操作人员来说并非可以简单地实施的技术。此外，即使是具有充足的经验，在蛋白质具有复杂的高级结构，在重折叠过程中易引起缔合·凝集的情况下，也不能容易地得到天然状态。

为了解决这些问题，提出了一系列新的重折叠方法。例如，到目前为止有报告使用色谱柱来降低缔合凝集风险的柱重折叠法(非专利文献1)；将目的物固定在载体上来抑制缔合凝集的固定化重折叠法(非专利文献2)；使用酸性和碱性缓冲液来代替变性剂，以部分变性状态而可溶化的pH提取法(非专利文献3)；和分子伴侣共存的方法(非专利文献4)；将反胶束以分子伴侣样使用的方法(非专利文献5)；利用表面活性剂的胶束的方法(非专利文献6)；在超过3000个大气压的超高压下不使用变性剂而进行提取的高压重折叠法(非专利文献7)；以及这些方法的并用法或变形法。

这些方法中最令人注目的技术就是，将变性剂提取后的蛋白质用含有表面活性剂的缓冲液稀释而抑制缔合凝集并同时部分地恢复结构，在下一步中使用环糊精等的表面活性剂结合剂强行地使表面活性剂从蛋白质中脱离出来而完成结构形成的多段式重折叠法的“人工分子伴侣系”。此技术的长处是，基本不必进行试错实验，仅需依照已确定的方法探索几种条件，在效果上可以抑制作为最深刻的问题的缔合凝集。有使用此技术而成功重折叠的例子的报告，也对此方法的变法进行了后续的研究(非专利文献8)。

但是，随着人工分子伴侣系的适用例的增加，我们知道，将添加的表面活性剂从蛋白质中脱离并不像报告的那样简单，为了发现适当的操作条件，依然需要繁杂的实验。此外，也有人诟病，多阶段操作引起步骤的繁杂而在工业生产的利用上引起了限制(非专利文献9)。

这样，即使是评价最高的人工分子伴侣系，对于没有经验的工作人员来说，作为容易且有效的对蛋白质进行重折叠的方法来说也不是十分合适的。

另一方面，已知有使用酰化肌氨酸而使蛋白质重折叠的方法，但酰化肌氨酸唯有在稀释后才能从蛋白质上脱离，如果不用特殊的方法除去，就不能恢复蛋白质的天然状态的高级结构(非专利文献10，专利文献1)。已知也有使用强碱调节的含有月桂酰-L-谷氨酸的表面活性剂溶液来使不溶性牛生长激素可溶化，通过超滤法降低表面活性剂浓度而重折叠的方法(专利文献2)，但此种方法难于有效地恢复生长激素以外的蛋白质的天然状态。此外，使蛋白质和高强度的碱性pH相接触会在蛋白质中引起不能修复的脱酰胺反应等化学变化。

[专利文献1]EP 0263902 A

[专利文献2]US专利6410694

[非专利文献1]A.Jungbauer，W.Kaar，R.Schlegl：Current opinion in Biotechnology 15，487-494(2004)

[非专利文献2]M Matsubara，et al.：FEBS LETT.，342，193-196(1994)

[非专利文献3]S.M.Singh and A.K.Panda：Journal of Bioscience and Bioengineering 99，303-310(2005)

[非专利文献4]D.Rozeman and S.H.Gellman：Journal of Biological Chemistry 271，3478-3487(1996)

[非专利文献5]A.J.Hagen，T.A.Hatton，and D.I.C.Wang：Biotechnol Bioeng.35，955-965(1990)

[非专利文献6]G.Zardeneta and P.H.Horowitz：Analytical Biochemistry 223，1-6(1994)

[非专利文献7]M.B.Seefeldt，Y.S.Kim，J.Carpenter，T.W.Randolph：Protein Science 14，2258-2266(2005)