[发明专利]蛋白质纯化用分离剂和蛋白质纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有特定配体的新型蛋白质纯化用分离剂、及其制造方法以及使用该分离剂的蛋白质纯化方法。

背景技术

为了能够从水性混合物中分离和纯化目标化合物，近年来，对多种技术进行了开发和/或优化。作为这种分离技术和/或纯化技术，例如，已知有离子交换色谱法、疏水作用色谱法(HIC)(例如，参照非专利文献1)、吸附色谱法等。这些色谱技术的多样性一方面使分离和/或纯化目标化合物的复杂程度最小化，另一方面反映了进行分离和/或纯化的困难程度。并且，上述各种技术存在其在工业规模上的广泛利用受到限制的多种缺陷。

例如，混合型色谱法用树脂在以下领域中使用：该树脂能够在疏水性条件下与目标化合物结合，能够在静电性(离子性)或亲水性条件下从该树脂放出目标化合物(例如，参照非专利文献2～5)。

现有的混合型色谱法用树脂的典型问题之一在于，在目标化合物的溶液中，不使用高盐浓度时，疏水性不太高的目标化合物对该树脂的结合效率并不太高。

例如，在非专利文献2中，预试验级别的蛋白质对该树脂的结合通过使用1M NaCl溶液实现。需要在含有目标化合物的水性溶液中添加盐的色谱技术，为了实现在工业规模下的收率而需要大量的试剂，需要相当多的工序。即，需要使用高浓度盐的色谱法用树脂并不是用于回收和/或纯化工业量的这种目标化合物的、最有效且成本上效果较好的方法。

因此，在专利文献1中，通过利用特定的离子性配体、并利用组合而成的混合型色谱法用树脂上的高配体密度，能够提供目标化合物在高离子强度和低离子强度下与树脂结合的这种充分的疏水性性质，所述特定的离子性配体由1个离子性官能团和1个间隔物构成，该间隔物通过共价键将配体(Ligand)连结到树脂的固体支撑基体上。另外，在专利文献1中，通过使离子性官能团介导的树脂上的电荷量增加，单纯地改变放出溶液的pH值，从而利用亲水性或静电性(离子性)相互作用而能够实现目标化合物从树脂上放出。

然而，在专利文献1记载的方法中，为了使间隔臂介于载体(固体支撑基体)与配体之间，其制造方法中需要经过许多非常复杂的工序，因而存在制造成本非常高的问题。

即，在专利文献1记载的方法中，间隔臂是指通过共价键方式将离子性官能团连接到固体支撑基体上的原子团或取代体。作为这种间隔臂，可列举出亚烃基、芳香族基团、烷基芳香族基团、酰胺基、氨基、脲基、氨基甲酸酯基、R₁和R₂分别为1个亚烃基(例如，C₁～C₆)且Y为氧或硫的-R₁-Y-R₂-基、以及与这些基团类似的基团。

并且，作为将上述间隔臂连接(键合)到载体上的方法，例如实施以下方法：使用羰基二咪唑(CDI)活化固体支撑基体，与氨基己酸反应，形成氨基甲酸酯中性键(参照专利文献1)。

另外，作为将配体连接(键合)到上述间隔臂上的方法，例如实施以下方法：使用碳二亚胺(EDC)，使胺配体与氨基己酸树脂发生偶联反应，形成酰胺键(参照专利文献1)。

这样，在专利文献1记载的方法中，在制造色谱法用树脂时，需要经过繁杂的工序。另外，根据配体、间隔臂、和固体支撑基体的选择，需要控制为最合适的pH值范围，还存在工序更加繁杂化的问题。

另一方面，现有的蛋白质纯化用的色谱法用填充剂，在吸附蛋白质时需要在缓冲液中添加大量的盐，并在之后将盐除去，因此需要消耗成本和劳力，从而期望开发出一种降低了盐的量的、利用简便的操作就能够吸附蛋白质的填充剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平10-506987号公报

非专利文献

非专利文献1：Biochimie，Vol.60，1～15页(1978)

非专利文献2：J.Chromatogr.，Vol.510，149～154页(1990)

非专利文献3：J.Chromatogr.，Vol.296，329～337页(1984)

非专利文献4：Chem.Rev.，Vol.89，309～319页(1989)

非专利文献5：J.Chromatogr.，Vol.317，251～261页(1984)

发明内容

发明要解决的问题