[发明专利]副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法

权利要求书

1.一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因插入在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述自杀载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，所述骨架载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI。

3.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，所述抗生素表达盒为具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。

4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，其核苷酸序列如SEQ IDNO3所示。

5.一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>转座子为模板，PCR扩增得到如Seq ID No.1所示的核苷酸序列，连接环化为骨架质粒pSD；

(2)以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，PCR扩增aroA基因，如SEQ ID NO4所示，并连接到质粒pGM-T上得到重组质粒pT-aroA；

(3)以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，

(4)使用cm的引物中酶切位点的限制性内切酶酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA，连接获得重组质粒pT-aroA-cm；

(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组自杀载体pSD-aroA-cm。

6.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增骨架载体的引物含有NotI位点，序列如下：

SD-F：5-ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG-3

SD-R：5-TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC-3。

7.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增aroA基因的引物如下：

aroA-F：5-TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG-3，

aroA-R：5-TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC-3，

所述酶切pT-aroA-cm和pSD的限制性内切酶为BamHI、SalI。

8.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有HindIII酶切位点，序列如下：

ChlF：5-TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC-3，

ChlR：5-AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA-3；所述酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA的限制性内切酶为HindIII。

9.筛选aroA基因插入突变的副猪嗜血杆菌突变菌株的方法，指将权利要求1～4任一所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体转化到副猪嗜血杆菌中进行共培养发生同源单交换，通过所述抗生素表达盒所对应的抗生素筛选阳性克隆获得突变菌株。