[发明专利]伊维菌素的单链抗体hsIVM8及其制备方法、其在免疫学检测的应用

权利要求书

1.一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8，其核酸序列为Seq NO.1。

2.一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8，其氨基酸序列为Seq NO.2。

3.一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8的制备，其特征在于：以伊维菌素-牛血清白蛋白结合物为包被抗原包被免疫管，通过固相抗原筛选法从人源噬菌体抗体库Tomlinson J中筛选展示伊维菌素单链抗体的噬菌体，用单克隆ELISA法筛选阳性噬菌体，将阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151进行可溶性抗体的表达，对单链抗体进行纯化，获得伊维菌素的单链抗体hsIVM8。

4.一种单链抗体hsIVM8在伊维菌素间接竞争ELISA检测方法的应用，其特征在于如下步骤：

A、间接非竞争ELISA法测定单链抗体hsIVM8的工作浓度及效价：选择OD值为1.0时的抗原抗体稀释浓度作为包被抗原、抗体工作浓度，以A_阳450/A_阴450＞2.1的最大稀释倍数作为抗体的最终效价；

B、将伊维菌素标准品和待测样品分别与两倍工作浓度的单链抗体hsIVM8等体积混合过夜，所述的伊维菌素标准品的浓度为0.01，0.1，2，5，10μg/mL；

C、将工作浓度的伊维菌素包被抗原加入酶标板，洗去未吸附抗原，再加入封闭液封闭酶标板剩余的蛋白结合位点，洗去多余的封闭物；将所述的伊维菌素标准品与单链抗体hsIVM8的混合液和所述的待测样品与单链抗体hsIVM8的混合液分别加入酶标板，使伊维菌素包被抗原与混合液中的标准品或待测样品对单链抗体hsIVM8进行竞争免疫结合反应，在酶标板的微孔底部形成伊维菌素包被抗原-抗体复合物，洗去游离的抗原和抗体；然后加入辣根过氧化物酶HRP标记的anti-His抗体，使在酶标板上形成包被抗原-抗体-二抗-HRP复合物，洗去未结合的酶标二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物；最后加入50μL/孔的2M H₂SO₄，终止反应；

D、用酶标仪测定不同浓度标准品孔及待测样品孔的吸光值，计算抑制率，绘制伊维菌素标准品浓度对抑制率的标准曲线，对线性范围进行回归分析，建立伊维菌素标准抑制曲线的回归方程I＝23.986LogC+35.267，R²＝0.9294，伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制中浓度IC₅₀为4.11μg/mL，伊维菌素最低检测限IC₁₀为0.088μg/mL，线性检测范围在0.1-5.0μg/mL，根据待测样品的吸光度计算待测样品的浓度；所述的I为伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制率，C为伊维菌素浓度。